【文章內(nèi)容簡介】 苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入 Kovacs 氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。 實驗證明靛基質(zhì)試劑可與 17 種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或 5甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。 1三糖鐵（ TSI）瓊脂試驗 試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置 36177。 1℃培養(yǎng) 18~24h，觀察結(jié)果。 本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（ 變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。 1氨基酸脫羧酶的測定 有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)基含胺類時呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。 接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。接種后封油，對照管與測定管同時接種封油。腸肝菌科的細(xì)菌于 37℃培養(yǎng) 4 天觀察。當(dāng)指 示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。 1硫化氫（ H2S）試驗 有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。 試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中，沿管壁穿刺接種，于36177。 1℃培養(yǎng) 24~28h，培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至 6 天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置 36177。 1℃培養(yǎng) 1~6 天。紙條變黑為陽性。 1檸檬 酸鹽或丙酸鹽的利用 某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。 接種與觀察結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培養(yǎng) 3－ 7 天，培養(yǎng)基呈堿性（藍(lán)色）者為陽性反應(yīng)，不變者則為陰性。 1利用丙二酸鹽試驗 丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個鑒別性特征。 許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。 接種和觀察結(jié)果： 用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng) 1－ 2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。 如測定培養(yǎng)基生長并變藍(lán)色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果。反之，如測定培養(yǎng)基未變色，而空白對照培養(yǎng)基生長，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。 1葡萄糖酸鹽的氧化 假單胞菌屬和腸道桿菌科的細(xì)菌，可氧化葡萄糖酸為 2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸無還原性基團(tuán)，氧化后形成酮基，則可將斐林氏試劑的呈藍(lán)色的銅鹽還原為磚紅色的 Cu2O 沉淀。 試驗方法：用 的磷酸緩沖液配制成 含 1％葡萄糖酸鹽（可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣）的溶液。分裝試管，每管 2mL。刮取適溫培養(yǎng) 18－ 24 小時的菌苔至 2mL 的葡萄糖酸鹽溶液中制成濃的菌懸液，置 30℃過夜，然后每管加入 的斐林試劑，放在沸水浴中加熱 10 分鐘，試管中液體由藍(lán)色變?yōu)辄S綠，綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽性反應(yīng)，如溶液不變色者為陰性。 1硫化氫 靛基質(zhì) 動力（ SIM）瓊脂試驗 試驗方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約 1/2 深度，置 36177。 1℃培養(yǎng) 18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力 ，然后加 Kovacs 氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置 10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。 本試驗用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。 1β 半乳糖苷酶（ ONPG）的測定 本試驗應(yīng)用于腸肝菌科的鑒定。 測定步驟： （ 1） 將測定菌接種于 TSI 斜面上，培養(yǎng)于 37℃ 18h（或其他最適溫度） （ 2） 挑取 1 大環(huán)菌苔入約 的生理鹽水中制成菌懸液，每管加 1 滴甲苯，搖勻（有助于酶的釋放），于 37℃放置 5 分鐘。 （ 3） 在菌懸液中加入 的 ，測定管置于 37℃水浴培養(yǎng)。經(jīng) 30 分、 …… 24h 進(jìn)行觀察，如有黃色者則為陽性。 1耐鹽性試驗 本試驗是觀察滲透壓對細(xì)菌生長的影響。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。一般可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適合生長的培養(yǎng)基，在其中加入不同量的 NaCl，接種后觀察其生長與否，以判斷其耐鹽性。 以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要，配成不同濃度的 NaCl，如 2％、 ％、 5％、7％、 10％等。培養(yǎng)基要求十分澄清，接種時應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培養(yǎng) 3－ 7d，與未接種的對照管對比，目測生長情況。 卵磷脂酶的測定 菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。 接種與觀察結(jié)果：將測試菌的菌液，環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對照管中，適溫培養(yǎng) 3 或 5 天觀察。假若與對照管相比較，在卵黃胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，則為陽性反應(yīng)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿，說明有卵磷酶的存在。 另一種方法： 以無菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當(dāng)于等量的生理鹽水搖勻后，取 10mL 卵黃液加入到溶化的約 50－ 55℃的 200mL 肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入培養(yǎng)皿，制 成卵黃平板，過夜后即可使用。 接種與觀察結(jié)果：將測試菌點接在卵黃平板上，每皿可分散點接 4－ 5 株菌、（芽孢桿菌以點接 1－ 2 株菌為宜）以不影響結(jié)果觀察為度，如測試厭氧菌，則須在上面加蓋無菌的蓋玻片。每株菌至少重復(fù)點接兩皿。適溫培養(yǎng) 1－ 2d 觀察，在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，說明該菌株有卵磷脂酶存在。 2石蕊牛奶的反應(yīng) 牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時呈淡紫色，酸性時呈粉紅色，堿性呈藍(lán)色，還原時則自上而下地褪色變白。 細(xì)菌對牛 奶的作用有一下幾種： （ 1） 產(chǎn)酸――細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。 （ 2） 產(chǎn)堿――細(xì)菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。 （ 3） 胨化――細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清。 （ 4） 酸凝固――細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變化，當(dāng)酸度很高時，可使牛奶凝固。 （ 5） 凝乳酶凝固――有些細(xì)菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時石蕊常呈藍(lán)色或不變色。 （ 6） 還原――細(xì)菌生長旺盛，使培養(yǎng)基氧化還原電位降低，因此石蕊還原褪色。