【正文】 酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基 PH 值下降至 以下，使甲基紅指示劑變紅。 試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于 MR－ VP 生化鑒定管，于 36通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)于 36177。 1176。 C 或 30176。 C（以 30176。 C 較好） 3~5 天，從第二天起，每日取培養(yǎng)液 1ml，加甲基紅指示劑 1~2 滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性 或至第 5 天仍為陰性、即可判定結(jié)果。 甲基紅為酸性指示劑， pH 范圍為 ~，其 pK 值為 。故在 以下，隨酸度而增強黃色，在 以上，則隨堿度而增強黃色，在 或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗。 VP 試驗 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱 V－ P（ +）反應(yīng)。 試驗方法： １） O’Meara 氏法：將 試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于 36177。 1176。 C 培養(yǎng) 48h，培養(yǎng)液 1ml 加 O’Meara 試劑（加有 %肌酸 Creatine 或肌酸酐 Creatinine 的 40%氫氧化鈉水溶液） 1ml，搖動試管 1~2min，靜置于室溫或 36177。 1176。 C 恒溫箱，若4h 內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張在 48~50176。 C 水浴放置 2h 后判定結(jié)果者。 ２） Barritt 氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于 36177。 1176。 C 培養(yǎng) 4 天、培養(yǎng)液 先加入 5176。 Cα萘酚（ 2naphthol）純酒精溶液 ,再加 40%氫氧化鉀水溶液 ， 搖動 2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色，若無紅色出現(xiàn)，靜置于室溫或 36177。 1176。 C 恒溫箱，如 2h 內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。 ３）快速法：將 %肌酸溶液 2 滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入 5%α 萘酚 3 滴， 40%氫氧化鈉水溶液 2 滴，振動后放置 5min，判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。 本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。 含碳化合物的利用 細菌能 否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系，因而作為鑒定依據(jù)。測定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因種而異?，F(xiàn)介紹 1 種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有些細菌還可適當(dāng)補加各種維生素。培養(yǎng)基可制成液體，分裝試管，也可制成固體平板。可用于測定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳氫化合物等。糖的含量一般為 1％，醇類酚類等的含量一般為 － ％，氨基酸的含量一般為 ％。因碳氫化合物不溶于水，可在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，或加入到 45℃的固體培養(yǎng)基中 ，振蕩后立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類不必滅菌。 接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗結(jié)果。平板培養(yǎng)用接種環(huán)點種，液體培養(yǎng)則用直針接種。每一測定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照。 適溫培養(yǎng) 7 天后觀察，凡測定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長情況，明顯超過空白培養(yǎng)基的生長量為陽性，否則為陰性。假若兩種培養(yǎng)基上生長情況差別不明顯，開在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種 3 次，如差別仍不明顯則以陰性論。 葡萄糖的氧化發(fā)酵試 驗 在細菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是 1 項重要依據(jù)。細菌對糖類的利用有 2 種類型： 1 種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此， Hugh 和 Leifson 提出一種含有低有機氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗廣泛用于細菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測定細菌從其他糖類或醇類產(chǎn) 酸的能力。 （ 1）接種 ：以 18－ 24h 的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養(yǎng)基中，每株菌接 4 管，其中 2 管用油封蓋（凡士林：液體石蠟＝ 1： 1 混合后滅菌），約加 － 1 厘米厚，以隔絕空氣為閉管。另 2 管不封油為開管，同時還要有不接種的閉管作對照。適溫培養(yǎng) 7 天觀察結(jié)果。 （ 2）結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸――僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（ 1－ 2d），后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。 糖或醇類發(fā)酵試驗 不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或 不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。 試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種后，置 36177。 176。C 培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。 本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細菌的鑒別，因而每次試驗，常需 同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍和 Andrade 指示劑。 注：對于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細菌微量生化鑒定管在 36℃ 18－24h 即可出結(jié)果。 硝酸鹽（ Nitrate）還原試驗 有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。 試驗方法：臨試前將試劑的 A（磺胺酸冰醋酸溶液）和 B（α－萘胺乙醇溶液）試液各 等量混合、取混合試劑約 、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，立即或于 10min 內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗 陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。 用α 萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。α 萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。 靛基質(zhì)（ Imdole）試驗 某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于 36177。 1C 培養(yǎng) 24h時后，取約 2ml 培養(yǎng)液，加入 Kovacs 氏試劑 2~3 滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先 加少量乙醚或二甲