【文章內(nèi)容簡介】 17 頁 第 4 頁 本課題的立題依據(jù)和研究內(nèi)容 立題依據(jù) 酪氨酸酚裂解酶（ Tyrosine Phenollyase， TPL， EC ） 也稱 β酪氨酸酶，在生物體內(nèi)催化 L酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物體外可將苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為 L酪氨酸，而 L酪氨酸常作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑、苯丙酮尿癥患者的必需氨基酸， 是 L多巴 的重要 制備原料。此外，該酶 在 磷酸吡哆醛的作用下， 能夠催化一系列的 α、 β 消除反應(yīng)、 β 取代 反應(yīng)以及 α、 β 消除反應(yīng)和消旋反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)。 因此 TPL 是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)的酶類，解決它的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)是一個(gè)迫在眉睫的問題。 本課題 應(yīng)用分子生物學(xué)手段，通過 PCR 體外擴(kuò)增技術(shù)，體外合成目的基因，并擴(kuò)大培養(yǎng)，得到目標(biāo)產(chǎn)物，簡化了生產(chǎn)過程，為生物制劑的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的借鑒。 研究內(nèi)容 （ 1）弗氏檸檬酸桿菌的培養(yǎng) （ 2） 目的基因的構(gòu)建與體外擴(kuò)增 （ 3）表達(dá)產(chǎn)物的鑒別 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 5 頁 2 實(shí)驗(yàn) 原理 SDS 法制備基因組 DNA 的原理 細(xì)菌基因組 DNA （染色體 DNA）的提取一般是先用溶菌酶處理，破壞 細(xì)菌細(xì)胞壁，然后再加入 SDS 和 /或蛋白酶 K，使細(xì)菌細(xì)胞裂解，同時(shí)解離與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，再利用有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)徹底變性。通過離心，細(xì)胞碎片及變性蛋白質(zhì)復(fù)合物被沉淀下來，而 DNA 擇留在上清液中，利用乙醇或異丙醇沉淀溶液中的 DNA。用無 DNA 酶的 RNA 酶水解溶液中的 RNA，最終獲得純度較高的細(xì)菌 DNA。 溶菌酶（ lysozyme）是一種能水解粘多糖的堿性酶，它通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中的 N乙酰胞壁酸和 N乙酰氨基葡萄糖之間的 β1,4 糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，從而使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂。 SDS 是一種強(qiáng) 陰離子去污劑，其主要作用是： ① 結(jié)合膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、核膜； ② 是核蛋白體（ DNP）中的蛋白質(zhì)與 DNA 分離； ③ 與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性而沉淀。蛋白酶 K能在 SDS 和 EDTA 存在的情況下保持較高的活性，可將與 DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分離出來。 EDTA 也具有降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，并抑制 DNase 活性的作用。 TrisHCl（ ）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。高濃度的 NaCl 可使蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)沉淀。上清液用酚 /氯仿 /異戊醇反復(fù)抽提除去蛋白質(zhì)，再用乙醇或異丙醇沉淀中的 DNA。 瓊脂糖凝膠電泳原理 DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 DNA 分子在高于等電點(diǎn)的 pH 溶液 中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動(dòng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈 DNA 幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下， DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即 DNA 分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的 DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。 DNA 分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的 DNA， 也 可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA 分子。 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 6 頁 PCR 反應(yīng)原理 聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction， PCR）是體外酶促合成特異 DNA片段的一種技術(shù)。利用 PCR 技術(shù)可在數(shù)小時(shí)之內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因或 DNA 片段，從而免除基因重組和分子克隆等一系列繁瑣操作。由于這種方法操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高并可自動(dòng)化，因而在分子生物學(xué)、基因工程研究以及對遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應(yīng)用 引物設(shè)計(jì)的基本原則 PCR 反應(yīng)中有兩條引物，即 5′端引物和 3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條 DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)）， 5′端引物與位于待擴(kuò)增片段 5′端上的一小段DNA 序列相同； 3′端引物與位于待擴(kuò)增片段 3′端的一小段 DNA 序列互補(bǔ)。 ① 引物長度： 1530bp，常用為 20bp 左右。 ② 引物堿基： G+C 含量以 4060%為宜， G+C 太少擴(kuò)增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC 最好隨機(jī)分布，避免 5 個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③ 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 ④ 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免 3 ′端的互補(bǔ)重疊。 ⑤ 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的 同源性不要超過 70%，引物 3′末端連續(xù) 8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 ⑥ 引物 3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是 G 和 C。 ⑦ 引物的 5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn) ，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列， 包括起始密碼子、終止密碼子等 PCR 反應(yīng)參數(shù) 1. 變性：在第一輪循環(huán)前 ,在 94℃ 下變性 510min 非常重要 ,它可使模板 DNA 完全解鏈 ,然后加入 Taq DNA 聚合酶 (hot start),這樣可減 少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不完全 ,往往使 PCR 失敗 ,因?yàn)槲醋冃酝耆?DNA 雙鏈會(huì)很快復(fù)性 ,減少 DNA 產(chǎn)量 .一般變性溫度與時(shí)間為 94℃ 1min 。在變性溫度下 ,雙鏈 DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全 ,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富?GC 的序列 ,可適當(dāng)提高變性溫度 .但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 7 頁 2. 退火：這是 PCR 的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列 有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從 55℃ 到 70℃ 。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm 低5℃, 當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗(yàn)的非可異性擴(kuò)增帶時(shí) ,以 2℃ 為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個(gè)引物 Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的 Tm 低5℃ ?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高 Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低 Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高 ,所得產(chǎn)物的特異性越 高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并 ,只用兩種溫度 (例如用 60℃ 和 94℃) 完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán) , 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成 ,反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。 3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為 72℃, 接近于 Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度 75℃.實(shí)際上 ,引物延伸在退火時(shí)即已開始 ,因?yàn)?Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從 20℃ 85℃. 延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度 .在一般反應(yīng)體系中 ,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成 1kb 長的DNA。延伸時(shí)間過長會(huì) 導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加 .但對很低濃度的目的序列 , 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后 ,都需要一步較長時(shí)間 (1030min)的延伸反應(yīng) ,以獲得盡可能完整的產(chǎn)物 , 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。 4. 循環(huán)次數(shù)：當(dāng)其它參數(shù)確定之后 , 循環(huán)次數(shù)主要取決于 DNA 濃度。一般而言 2530 輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多 ,會(huì)使 PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng) 2530 輪循環(huán)擴(kuò)增后 , 反應(yīng)中 Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足 , 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠 , 需要進(jìn)一步擴(kuò)增 ,可將擴(kuò)增的DNA 樣品稀釋 103105 倍作為模板 , 重新