【文章內(nèi)容簡介】 上升，菌體衰老， 80％形成空泡，每 2～ 3 小時取樣分析一次，當(dāng)酶活不再武漢紡織大學(xué) 年產(chǎn) 1000 噸淀粉酶生產(chǎn)工藝設(shè)計 4 升高，可結(jié)束發(fā)酵。而后向發(fā)酵液中添加 2%CaCl2， %Na2HPO4， 50～ 55℃加熱處理 30分鐘，以破壞共存的蛋白酶，促使膠體凝聚而易于過濾。冷卻到 35℃，加入硅藻土為助濾劑過濾。濾液加 ，洗滌同發(fā)酵液 混合 ，真空濃縮數(shù)倍后，加（ NH4） 2SO4鹽析，鹽析物加硅藻土后壓濾，濾餅于 40℃烘干，磨粉而成。按此工藝，由酶液到粉狀酶制劑的收率為 70％。 對于固體發(fā)酵有以下缺點(diǎn) [13]： 1. 限于低濕狀態(tài)下生長的微生物，故可能的流程及產(chǎn)物較受限，一般較適合于真菌。 2. 在較致密的環(huán)境下發(fā)酵，其代謝熱的移除常造成問題，尤其是大量生產(chǎn)時，常限制其大規(guī)模的產(chǎn)能。 3. 固態(tài)下各項參數(shù)不易偵測，尤其是液體發(fā)酵的各種探針不適用于固體發(fā)酵， pH值、濕度、基質(zhì)濃度不易調(diào)控， Biomass不易量測，每 批次發(fā)酵條件不易一致，再現(xiàn)性差。 4. 不易以攪拌方式進(jìn)行質(zhì)量傳遞，因此發(fā)酵期間，物質(zhì)的添加無法達(dá)到均勻。 5. 由于不易偵測，從發(fā)酵工程的觀點(diǎn)來看，許多工作都只是在定性或觀察性質(zhì)，故不易設(shè)計反應(yīng)器，難以量化生產(chǎn)或設(shè)計合理化的發(fā)酵流程。 6. 固體發(fā)酵的培養(yǎng)時間較長，其產(chǎn)量及產(chǎn)能常低于液體發(fā)酵。 7. 萃取的產(chǎn)物常因黏度高不易大量濃縮。 而對于 發(fā)酵罐深層培養(yǎng)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、效益大等優(yōu)點(diǎn) 故選用 層發(fā)酵法生產(chǎn) α 淀粉酶 。 工藝 流程簡述 菌種的選育及制備 菌種選擇性分離的步驟一 般是： 含微生物材料采集 —— 標(biāo)本材料的預(yù)處理 —— 菌種的分離 —— 富集培養(yǎng) —— 菌種初選—— 菌種復(fù)選 —— 性能鑒定 —— 菌種保藏。 土壤是微生物聚集最豐富的場所，菜園和農(nóng)田耕作層土壤含有豐富的有機(jī)物常以細(xì)菌和放線菌居多，由于枯草芽孢桿菌生活在中性的環(huán)境中，可以采集中性的土壤。 采集后 可用平板劃線法進(jìn)行菌種分離。由于野生型菌株生產(chǎn)性能較差， 可進(jìn)行 誘變育種 ， 利用物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)遺傳特性發(fā)生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求如高產(chǎn)的個體 。 培養(yǎng)基的配制 1） 培養(yǎng)基的類型 培養(yǎng)基的種類很多 ， 可以根據(jù)組成 、 狀態(tài)和用途等進(jìn)行分類，按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基 ， 種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基 。 微生物大規(guī)模發(fā)酵設(shè)計主要用到孢子 ,種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類型。 2） 孢子培養(yǎng)基 孢子培養(yǎng)基配制的目的 是 供菌體繁殖孢子的，常采用的是固體培養(yǎng)基，對這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長快速，產(chǎn)生數(shù)量多而優(yōu)質(zhì)的 孢子 ，并且不會引起菌體變異。對孢子培養(yǎng)基的要求： ① 營養(yǎng)不要太豐富； ② 所用無機(jī)鹽的濃度要適量； ③ 注意培養(yǎng)基的 pH和濕度。 淀粉酶的孢子培養(yǎng)基配置如下：將麩皮 5％、豆餅粉 3％、蛋白胨 %、瓊脂 2%（ pH ）制成斜面培養(yǎng)基，在 20 min 。 武漢紡織大學(xué) 年產(chǎn) 1000 噸淀粉酶生產(chǎn)工藝設(shè)計 5 3） 種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯成為活力強(qiáng)的種子。對于種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也比較高些，濃度以稀薄為好，可以達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長和繁殖。 α 淀粉酶的種子培養(yǎng)基的配置：將豆餅 1%、 蛋白胨和酵母膏各 %、氯化鈉 %配置成種子培養(yǎng)基 (pH ～ )，在 20 min。 4） 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基的要求是營養(yǎng)要適當(dāng)豐富和完全適合于菌種的生理特性和要求， 使菌種迅速生長、健壯，能在比較短的周期內(nèi)充分發(fā)揮產(chǎn)生菌合成發(fā)酵產(chǎn)物的能力，但要注意成本和 能耗 。 α 淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方是：麩皮 70％、小米糠 20％、木薯粉 10%、燒堿 %，加水使水量達(dá) 60％，常壓蒸汽滅菌 1h。 種子擴(kuò)大培養(yǎng) 本發(fā)酵屬于一級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，二級發(fā)酵。設(shè)計流程如下： 孢子 → 錐形瓶 → 種子罐 → 發(fā)酵罐 1） 孢子制備 將保存在淀粉瓊脂斜面上的枯草 芽孢桿菌 孢子用無菌水洗下，接種到錐形瓶中，在 35℃靜置培養(yǎng) 2～ 4天，待長出大量孢子 后 作為接種用 的 種子。 2） 種子制備 將保藏的菌種接種到 馬鈴薯茄子瓶斜面（ 20%馬鈴薯煎出汁加 MgSO47H2O 5 mg/L ，瓊脂 2%， pH ～ ） ， 37℃ 培養(yǎng) 3 天 。 然后接入到 20L種子罐， 37℃ 攪拌 ， 通風(fēng)培養(yǎng) 12～14 小時。此時菌種進(jìn)入對數(shù)生長期（鏡檢細(xì)胞密集，粗壯整齊，大多數(shù)細(xì)胞單獨(dú)存在，少數(shù)呈鏈狀，發(fā)酵液 pH ～ ,酶活 5～ 10U/mL） ， 再接種到發(fā)酵罐。 3） 發(fā)酵罐培養(yǎng) 培養(yǎng)基的配制：用麥芽糖液配置成含麥芽糖 6％、豆粕水解液 6％～ 7％、 Na2HPO412H2O ％、 (NH4)2SO4 ％、 CaCl2 ％、 ％、豆油 1kg、深井水 20L，調(diào) pH至 ～。 發(fā)酵 罐培養(yǎng)基經(jīng)消毒滅菌冷卻后接入 3%～ 5%種子培養(yǎng)成熟液 。 培養(yǎng)條件為：溫度37177。1℃ ，罐壓 ／ cm2，風(fēng)量 1～ 20h 為 1： ， 20 h 后 1： ，培養(yǎng)時間為 28～ 36 h。 空氣滅菌 此課題為好氧發(fā)酵，以空氣作為氧源。根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理規(guī)范的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求。獲得無菌空氣的方法有：輻射滅菌、化學(xué)滅菌、加熱滅菌、靜電除菌、過濾介質(zhì)除菌等。 過濾介質(zhì)除菌是 目前發(fā)酵工業(yè)中空氣除菌的主要手段，其介質(zhì)有棉花過濾器、超細(xì)玻璃纖維紙、石棉濾板、金屬燒結(jié)管等。 武漢紡織大學(xué) 年產(chǎn) 1000 噸淀粉酶生產(chǎn)工藝設(shè)計 6 1） 過濾除菌流程及設(shè)備 流程如下： 采風(fēng)塔 → 空氣粗過濾器 → 空氣壓縮機(jī) → 儲氣罐 → 冷卻器 → 旋風(fēng)分離器 → 冷卻器 → 絲網(wǎng)除沫器 → 空氣 加熱器 → 總空氣過濾器。 設(shè)備如下： ：采風(fēng)塔建在工廠的上風(fēng)頭，高至少 10 m,氣流速度 8 m/s。 ：主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保護(hù)空氣壓縮機(jī)，同時起一定的除菌作用，減輕總過濾器的負(fù)擔(dān)。 ：作用是提供動力，以克服隨后各設(shè)備的阻力。 ：作用 是消除壓縮空氣的脈動。 要求： H/B=2～ V=（ ～ ） V1 其中， H為罐高； B為罐直徑； V1為空壓機(jī)每分鐘排氣量（ 20℃ ， 1105Pa 狀況下）。 ：是利用離心力進(jìn)行氣 固或氣 液沉降分離的設(shè)備。作用是分離空氣中被冷卻成霧狀的較大的水霧和油霧粒子。 ：空壓機(jī)出口溫度氣溫在 120℃ 左右，必須冷卻。另外在潮濕的地域和季節(jié)還可以達(dá)到降濕的目的。 ：可以除去空氣中絕大多數(shù)的 20181。m 以上的液滴和 1181。m以上的霧滴，一般采用規(guī)格為直徑 ㎜ 40 孔且高度為 150㎜的不銹鋼絲網(wǎng)。 ：列管內(nèi)走空氣，管外走蒸汽。 可將空氣濕度由 100%降低到 70%以下。 ：填充物按下面順序安裝：孔板 → 鐵絲網(wǎng) → 麻布 → 活性炭 → 麻布 → 棉花 → 麻布 → 鐵絲網(wǎng) → 孔板。介質(zhì)要緊密均勻，壓緊一致，上下棉花層厚度為總過濾層厚度的 1/4，中間活性炭層為 1/3。 2） 無菌空氣的檢查 現(xiàn)在采用的無菌 檢查 實(shí)驗方法有肉湯培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法。這里采用斜面培養(yǎng)法來檢查。具體方法如下： 500ml 三角瓶內(nèi)裝斜面培養(yǎng)基 50m1，其組成為麥芽糖 6％、豆粕水解液 6％、Na2HPO412H2O ％、 (NH4)2SO40. 4％、 CaCl2 ％、 NH4C1 ％， pH ～ ，接種后置旋轉(zhuǎn)式搖床亡， (37177。1)℃ 下培養(yǎng) 28h左右備用。 發(fā)酵過程的工藝控制 1） 發(fā)酵過程的補(bǔ)料策略 中間補(bǔ)料是在發(fā)酵過程中補(bǔ)充某些營養(yǎng)物料、水或產(chǎn)酶促進(jìn)劑，以滿足微生物的代謝活動和產(chǎn)酶的需要。 α 淀粉酶生產(chǎn)中 要 經(jīng)常補(bǔ)料，用 3倍年度濃度碳源的培養(yǎng)基補(bǔ)料，體積相當(dāng)基礎(chǔ)料的 1/2，從培養(yǎng) 12h開始，每小時 1次，分 30余次補(bǔ)加完畢。延長了發(fā)酵時間，提高了酶活力和 單罐產(chǎn)量。 2） 發(fā)酵過程 pH 值的控制 各種微生物需要在一定的 pH環(huán)境中方能正常生長繁殖。 培養(yǎng)基中 C/N比值高，發(fā)酵液傾向于酸性， pH偏低； C/N比值低，發(fā)酵液傾向于中性或堿性， pH偏高。 α 淀粉酶最適 pH為 ～ 。因此，在發(fā)酵過程中，可通過添加適量的尿素或碳酸鈣等來調(diào)節(jié) pH上升或下降。 武漢紡織大學(xué) 年產(chǎn) 1000 噸淀粉酶生產(chǎn)工藝設(shè)計 7 3） 發(fā)酵過程溫度的控制 溫度對微生物的生長、產(chǎn)物的合成和代謝調(diào)節(jié)有重要作用。溫度變化一方面影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白的性質(zhì)，另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì) 。 不同的菌種有著不同的最適溫度?？莶輻U菌發(fā)酵溫度控制在 35℃ ～ 37℃ 最適宜。 4） 溶氧的控制 α 淀粉酶發(fā)酵是需氧發(fā)酵，無論是基質(zhì)的氧化，菌體的生長還是產(chǎn)物的合成均需大量的氧氣 。 若發(fā)酵液中氧氣不足，可通過加大通氣量，適當(dāng)降低溫度，提高罐壓，補(bǔ)水，提高攪拌速度來控制。 α 淀粉酶發(fā)酵過程中， 0～ 12 h通氣量為 1： vvm， 12 h至發(fā)酵結(jié)束通氣量為 1：（ ～ ） vvm 攪拌轉(zhuǎn)速 200r/min。 罐壓 。 5） 染菌的控制 在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕則影響產(chǎn)品的質(zhì)和量 、 重則倒罐或停產(chǎn) 、 影響工廠效益。因此要嚴(yán)格無菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空 氣設(shè)備，操作要慎重，設(shè)備滅菌要徹底。若在前期染菌，應(yīng)重新滅菌；中期染菌，應(yīng)偏離雜菌生長條件；后期染菌，可提前或及時放罐。 可能出現(xiàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象： ：可能是噬菌體污染或營養(yǎng)成分缺乏； ：會抑制微生物的生長，考慮可能是污水污染； ：可能原因是種子生長能力降低，檢測種子是否衰退，發(fā)酵條件是否合適，以及營養(yǎng)成分是否全面，尤其注意缺磷； ： 用緩沖對來調(diào)節(jié)，檢查是否染雜菌，碳氮比是否合適； ：最可能的原因就是營養(yǎng)成分不足。 下游加工 下游加工過程是生物工程的一個組成部分，是生物化工產(chǎn)品通過微生物發(fā)酵過程、酶反應(yīng)過程或動植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得，以上述發(fā)酵、反應(yīng)液或培養(yǎng)液分離 、 精制有關(guān)產(chǎn)品的過程。 下游加工過程的一般工藝流程為： 固體 → 細(xì)胞破碎 → 分離 發(fā)酵液 → 預(yù)處理 → 固液分離 液體 → 初步純化 → 高度純化 → 成品加工 1） 發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理 預(yù)處理就是除去高價離子和蛋白質(zhì)，對高價離子的去除可以采用草酸或磷酸，草酸它與鈣離子生成的草 酸鈣，還能促使蛋白質(zhì)沉淀，加磷酸既能降低鈣離子也能降低鎂離子。對于蛋白質(zhì)的沉淀可以加入絮凝劑，調(diào)節(jié) pH 值或加熱。過濾：采用鼓式真空過濾器，過濾前加去乳化劑并降溫。 2） 提取 α 淀粉酶常用的提取方法有：鹽析法、乙醇淀粉吸附法和噴霧干燥法，這里用鹽析法。具體方法：發(fā)酵液經(jīng)熱處理，冷卻到 40℃ ，加入硅藻土為助濾劑過濾。濾餅 加 倍水洗滌，洗液同發(fā)酵液合并后，在 45℃ 真空濃縮數(shù)倍后，加 (NH4)2SO4 至 40%飽和度。鹽析沉淀武漢紡織大學(xué) 年產(chǎn) 1000 噸淀粉酶生產(chǎn)工藝設(shè)計 8 物加硅藻土后過濾，濾餅于 40℃ 烘干磨粉即成粗酶制品。由酶液到粉狀制酶劑的收率為 70%。 成品固體酶制劑的干燥方法有烘房、氣流干燥、噴霧干燥、沸騰干燥、振動干燥和真空冷凍干燥。由于噴霧干燥生產(chǎn)能力大，維修保養(yǎng)簡單，因此生產(chǎn)中常采用這種方法。 3） 純化 α 淀粉酶的純化方法可采用凝膠過濾法，就是以特定的凝膠物質(zhì)為分子篩裝入層析柱，再通過分離溶液時大于凝膠孔徑的分子會被排阻在膠粒外，因此它們將 “ 繞道通過 ” ；小于該孔徑的分子，由于可以自由出入膠粒內(nèi)外，因此將沿著膠粒縫隙而直接流出。通過一段程度的凝膠層析柱后，大小分子將依次先后流出。 枯草芽孢桿菌生產(chǎn)發(fā)酵 α 淀粉酶工藝總流程圖 孢子斜面 ↓ 孢子懸浮液 ↓ 種子罐 ↓ 發(fā)酵罐 ↓ 補(bǔ)料罐 ↓ ↓ 熱處理 粗濾 ↓ 鹽析 ↓ 壓濾 ↓ ↓ 干 燥 噴霧干燥 ↓ 粉碎 ↓ ← 填充劑 混粉 ← 包裝 武漢紡織大學(xué) 年產(chǎn) 1000 噸淀粉酶生產(chǎn)工藝設(shè)計 9 4 工藝計算 工藝技術(shù)