【文章內(nèi)容簡介】 除實驗被廣泛用于抗氧化活性的測定，具有廣 東海洋大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 3 穩(wěn)定、快速、簡便、靈敏的優(yōu)點。國外很多學(xué)者運用 DPPH 溶液的紫外 可見光分光光度計的 吸光度變化作為清除 DPPH 自由基能力的測定方法 [2324]。 硇洲馬尾藻（ Sargassum naozhouense Tseng et Lu）屬于褐藻門（ Phaephyta）圓子綱（ Cyclospreae）墨角藻目（ Fucales）馬尾藻科（ Sargassaceae）馬尾藻屬（ Sargassum） [12]，其為廣東特有物種，主要分布于硇洲島和雷州半島等地，多生長在中低潮帶的巖石上。硇洲馬尾藻具有高蛋白、低脂肪、低熱量、高膳食纖維且富含鋅、鐵、鉀等微量礦質(zhì)元素的優(yōu)點，是理想的天然保健食品原料 [25]，有著很高的藥用和食用價值，是南方高溫海區(qū)非常具有規(guī)模化栽培前景和商業(yè)價值的本土種類。其重要作用還體現(xiàn)在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，可用作實施海洋生態(tài)修復(fù)或重建淺海藻場。 銅藻（ Sargassum horneri）屬于褐藻門（ Phaephyta）圓子綱（ Cyclospreae）墨角藻目（ Fucales）馬尾藻科（ Sargassaceae）馬尾藻屬（ Sargassum），又稱草茜、竹茜菜、柱囊馬尾藻，銅藻可用于堆肥或作為季節(jié)性食材，甚至發(fā)展成為發(fā)酵 生產(chǎn)酒精 的原料。其分布區(qū)很廣，南可至 香港 ，是一種常形成海藻林的常見溫帶 馬尾藻 ，能在每年的冬末春初大量繁殖，最快時每天可以長約一米，最長的個體 可達(dá)十米 [12]。硇洲島是廣東的主要銅藻產(chǎn)地之一，其易養(yǎng)殖、收割，且產(chǎn)量高，目前相關(guān)市場開發(fā)程度較低，其實具有較高的食用和藥用價值，可進(jìn)行更多的生產(chǎn)提取，如可用來制銅藻罐頭、動物飼料和天然抗癌藥物。 鮮魚頭草屬于褐藻門（ Phaephyta）圓子綱（ Cyclospreae）墨角藻目（ Fucales）馬尾藻科（ Sargassaceae）馬尾藻屬（ Sargassum）。其藻株高約 10~20cm，葉略卷曲，寬約 ~，呈褐色，是典型的馬尾 藻，目前暫時只有俗名，正在鑒定中的馬尾藻。 主要內(nèi)容和關(guān)鍵問題 本課題的主要研究內(nèi)容是從已有的研究基礎(chǔ)及相關(guān)文獻(xiàn)報道著手，參考 Federico Ferreres , Graciliana Lopes , Angel GilIzquierdo 等人的方法 [26]提取， Folin Ciocalteu 比色法 [27]測定褐藻多酚含量，磷鉬絡(luò)合物法 [28]檢測總抗氧化能力，二苯代苦昧?；杂苫?DPPH178。 )法 [2122]檢測自由基清除能力，對 3 種湛江本地產(chǎn)的馬尾藻中褐藻進(jìn)行檢測來驗證其褐藻多酚 含量、抗氧化性和自由基清除能力。 本課題將進(jìn)行以下內(nèi)容： ① 褐藻多酚的提取分離； ② 褐藻多酚含量的測定； ③ 褐藻多酚總抗氧化能力的檢測； ④ 褐藻多酚的 DPPH178。自由基清除能力檢測。 2 材料和方法 實驗材料、試劑和儀器 材料 硇洲馬尾藻，銅藻， 鮮魚頭草 均在湛江硇洲島采集。 廣 東海洋大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 4 主要試劑 folin酚試劑（北京鼎國生物技術(shù)有限公司），沒食子酸（ GA）（ 福建南方化工有限公司 ， 色譜純），無水 Na2CO3（分析純）， 三水合醋酸鈉（分析純），冰乙酸（分析純）， TPTZ試劑（美國 Sigma 公司），濃 鹽酸（分析純），六水合三氯化鐵（分析純）， DPPH 試劑（美國 Sigma 公司），無水乙醇（分析純），正己烷（分析純），丙酮（分析純），甲醇（分析純），甲苯（分析純），濃硫酸（分析純），七水合硫酸亞鐵（分析純），微晶纖維素（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，柱層析），實驗用水如無特殊說明均為超純水。 主要儀器與設(shè)備 儀器名稱 型號 生產(chǎn)廠家 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 DIGITAL WATER BATH 循環(huán)水式真空泵 N1000 SB1000 SHZD(Ⅲ ) EYELA EYELA 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH8 常州澳華儀器有限公司 紫外分光光度計 UV2550 日本島津公司 高速冷凍離心機(jī) CR22GⅡ 日本日立公司 超聲波清洗器 KQ500E 昆山市超聲波儀器有限公司 電子天平 AUY220 SHIMADZU 超純水機(jī) LD50GD 重慶利迪實驗儀器設(shè)備有限公司 搖床 SKY1102C SUKUN 電熱鼓風(fēng)干燥箱 DHG9240A 上海 恒科 學(xué)儀器有限公司 無菌注射針筒 50ml 中國醫(yī)療器材公司 褐藻多酚的提取方法及步驟 ① 3 種新鮮馬尾藻樣品在采集之后 , 用清水反復(fù)清洗除去附生生物后，再用蒸餾水洗滌 3 次 , 然進(jìn)行植株的物種鑒定，放置于冰箱中零下 20℃低溫保存?zhèn)溆?。實驗時取出保藏的 3 種馬尾藻，在研磨缽中研磨碎后，用電子天平分別于廣口瓶中 3 次平行 稱取 馬尾藻， 銅藻， 鮮魚頭草備用。 ② 按質(zhì)量體積比 1:6（樣品：正己烷）加入正己烷溶液，使樣品完全浸沒后，放置在搖床上（ 25℃， 120r/min）搖晃以加快浸取速度，經(jīng)過 6h 后，浸取完畢。同中等密度濾紙過濾，濾渣按上述方法重復(fù)提取 3 次，確保除去脂質(zhì)。之后將濾渣倒出廣口瓶置于濾紙上，自然干燥濾渣 12h，確保正己烷已經(jīng)揮發(fā)不會影響下面的實驗。獲得 3 種馬尾藻的粗提物 I。 ③ 再按照質(zhì)量體積比 1:6（濾渣： 70%丙酮溶液）加入 70%丙酮溶液，使樣品完全浸沒后，放置于搖床上（ 25℃， 120r/min）晃動浸取 1 小時， 4000r/min 離心 5min，按上述方法重復(fù)提取 3 次，合并離心液，得粗提液。 ④ 將離心液倒入 500ml 旋蒸瓶中置于 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （ 40℃， 85r/min） 蒸餾去丙酮和水。廣 東海洋大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 5 然后加入甲醇溶液以超聲波清洗器溶解附著在旋蒸瓶上的提取物，換 250ml 旋蒸瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （ 40℃， 85r/min） 旋蒸干燥至恒重后， 3 次平行， 用差量法算出提取物的質(zhì)量分別為 、 。得 3 種馬尾藻粗提物 II。再以甲醇溶解，加入 2 倍質(zhì)量的微晶纖維素，繼續(xù)旋蒸干燥得到微晶纖維素提取物。 ⑤ 將微晶提取物從旋蒸瓶中倒出后，以 50ml 針筒過柱，具體步驟如下 首先在針筒底部塞入一層棉花，確保微晶顆粒不會由針筒口流出，接著加入一層微晶纖維素約 2 藥勺，然 后放入旋蒸干燥好的纖維素提取物，再在上面覆蓋一層微晶纖維素，確保充分提取。把甲苯緩緩倒入針筒中，使甲苯通過兩層纖維素后由針筒口流出，反復(fù)操作，過柱直至甲苯洗出液呈無色，收集洗出液。然后加入 70%丙酮，使 70%丙酮通過兩層纖維素后由針筒口流出，提取 3 次，收集并合并洗出液后， 4000r/min 離心 5min，即得到丙酮提取液。 ⑥ 將提取液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中 30176。旋蒸除去其中混雜的甲苯和丙酮，待無液體蒸出后，用超聲波震蕩使得附著于璧山的提取物溶解，所得溶液即為最終樣液，放置于冰箱中零下 20℃保存。 ⑦ 將實驗中用 到的各種有機(jī)溶劑在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸以回收有機(jī)溶劑，供反復(fù)使用。 總酚的測定 試劑的配制 880mg/L 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取 沒食子酸，用水溶解，定容至 50ml。 12% Na2CO3溶液：準(zhǔn)確稱取無水 溶于 40ml 水中，定容至 100ml。 1mol/L folin酚試劑乙：取一定量的 folin酚試劑乙原液以 1:1 比例稀釋后待用。 檢測方法 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，采用 Folin Ciocalteu 比色法 [13]。 Folin酚乙液可與多酚在 堿性條件下發(fā)生氧化反應(yīng)，形成鎢鑰蘭復(fù)合物，復(fù)合物呈藍(lán)色，在避光條件下反應(yīng) 60min 后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，復(fù)合物在λ =765nm處有最高吸收峰并無干擾峰，在一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度變化值與總酚含量呈比例關(guān)系，故可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出對應(yīng)濃度，用沒食子酸（ GA） mg/g 海藻濕基來表示海藻的多酚含量。 實驗具體操作如下： 用移液管量取 1ml 待測液于 10ml 具塞試管中，然后準(zhǔn)確加入 2ml 1mol/LFolin酚乙液，震蕩搖勻，然后靜置 2min，接著緩慢的加入 6ml 的 12% Na2CO3，防止溶液沖出試管，迅速搖勻，用超 純水定容至 10ml，室溫下避光放置 60min 使反應(yīng)穩(wěn)定后，用紫外 可見分光光度計在λ =765nm 處測定吸光度，以 1ml 超純水代替樣品進(jìn)行上述過程，作為空白對照。以沒食子酸作為衡量多酚含量的標(biāo)準(zhǔn)。得相對的褐藻多酚總含量，用 mg GA/g 海藻濕基表示。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定和樣品含量計算 取配制好的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制系列濃度為 0、 、 、 、 ，采用 廣 東海洋大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 6 中的 Folin Ciocalteu 比色法，建立濃度和吸光度的關(guān)系曲線（圖 1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。 代入測得的樣品吸光度 值，即可得出樣品的相對 GA 濃度，換算可得每克樣品相對 GA含量。 總抗氧化能力的檢測 [8] 試劑配制 試劑液（內(nèi)含 、 28mmol/L 磷酸鈉和 4 mmol/L 鉬酸銨）：量取 98%H2SO4，用超純水稀釋一定程度后，再稱取 四水合鉬酸銨和 十二水合磷酸鈉，用一定超純水震蕩溶解于燒杯后，再將溶液倒入上述裝有稀釋硫酸的容量瓶中，用超純水定容至 500ml。 檢測方法 采用磷鉬絡(luò)合物法 [28]。其測定原理是抗氧化物質(zhì)將 Mo(Ⅵ )還原后 生成綠色的 Mo(V)絡(luò)合物，在 695 nm處有最大吸收峰且無干擾峰。測得的吸光度值在一定范圍內(nèi)與被測物質(zhì)的抗氧化物質(zhì)活性成比例關(guān)系。故可通過比較 3 中馬尾藻樣品的吸光度，得出其抗氧化性大小的順序。該方法有良好的可操作性和再現(xiàn)性，且成本低廉，適用于多種樣品溶劑的抗氧化能力測定。 具體操作步驟參考 Prieto 等 [28]的方法并加以改進(jìn)：用移液管準(zhǔn)確量取 樣品液于5ml 試管中，接著量取并加入 試劑液，充分搖勻。然后在恒溫水浴 90 min，待反應(yīng)穩(wěn)定后，迅速用紫外 可見光分光光度計于λ =695 nm下 測吸光度，比較 3