【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 可選用合適的酶予以分解除去。酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，可以較大幅度提高收率，故酶解不失為一種最大限度從植物體內(nèi)提取有效成分的方法之一。傳統(tǒng)的提取方法（如煎煮，有機(jī)溶劑浸出和醇處理方法）提取溫度高、提取率低、浪費(fèi)乙醇、成本高，不安全；而選用恰當(dāng)?shù)拿?，可通過(guò)酶反應(yīng)較溫和地將植物組織分解，加速有效成分的釋放提?。贿x用相應(yīng)的酶可將影響液體制劑的雜質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等分解去除，也可促進(jìn)某些極性低的脂溶性成分轉(zhuǎn)化為糖苷類易溶于水的成分而有利于提取。這是一項(xiàng)很有前途的新技術(shù)。目前，用于中藥提取方面研究較多的是纖維素酶，大部分的中藥材的細(xì)胞壁是由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)；纖維素則是由βD葡萄糖以1,4β葡萄糖苷鍵連接，用纖維素酶酶解可以破壞βD葡萄糖鍵，使植物細(xì)胞壁破壞，有利于對(duì)有效成分的提取。纖維素酶用于以纖維素為主的中藥材提取有效成分，的確能提高有效成分的收率，但要拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域，還需要進(jìn)一步深入探討酶的濃度、底物的濃度、溫度、酸堿度、抑制劑和激動(dòng)劑等對(duì)提取物有何影響。誠(chéng)然，酶法目前在動(dòng)物類藥材提取方面應(yīng)用得較為廣泛。 半仿生提取法半仿生提取法[4,5]（簡(jiǎn)稱SBE法）是將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合，從生物藥劑學(xué)的角度，模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的原理，為經(jīng)消化道給藥中藥制劑設(shè)計(jì)的一種新的提取工藝。即將藥料先用一定pH的酸水提取，繼以一定pH的堿水提取，提取液分別濾過(guò)、濃縮，制成制劑。它將分析思維與系統(tǒng)思維統(tǒng)一起來(lái)，形成觀察問(wèn)題的新思路，即在中藥提取中堅(jiān)持了“有成分論，不唯成分論，重在機(jī)體的藥效學(xué)反應(yīng)”。這種新提取法可以提取和保留更多的有效成分，能縮短生產(chǎn)周期，降低成本，多種復(fù)方制劑的研究提示，“SBE法”有可能替代“WE法”（即水提取法）。而且這種提取方法在中藥飲片顆?；难芯恐校灿兄鴱V闊的應(yīng)用前景。 破碎提取法破碎提取法[6]是通過(guò)對(duì)植物材料在適當(dāng)溶劑中充分破碎而達(dá)到提取的目的。他們根據(jù)流體力學(xué)原理，參照國(guó)外先進(jìn)技術(shù)，研制出一種新型的破碎提取器，這種提取器主要由高速電機(jī)、破碎刀具、容器、底座、主柱及調(diào)速開(kāi)關(guān)等組成。電機(jī)轉(zhuǎn)速分快、慢兩檔，破碎提取一次僅需12min，提取后藥材被破碎成勻漿狀。通過(guò)選用各種性質(zhì)的藥材，分別進(jìn)行冷浸提取法、滲流提取法、回流提取法和破碎提取法所得提取物收得率和薄層層析對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明，破碎提取法提取快速、完全，且不需加熱，從而可以節(jié)約大量的時(shí)間、溶劑和能源。破碎提取法雖然操作簡(jiǎn)單，避免了高溫加熱，提取時(shí)間也極短，但提取物的收率并不是最高，且也局限于實(shí)驗(yàn)研究，要應(yīng)用于大生產(chǎn)，還需進(jìn)一步研究。 青篙素的制備 青篙素的化學(xué)合成化學(xué)合成青篙素這一復(fù)雜的天然分子是有機(jī)化學(xué)家所面臨的挑戰(zhàn)。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)所對(duì)青篙素及其一類物的結(jié)構(gòu)和合成進(jìn)行了大量的工作[33,34]。1986年，Xu等報(bào)道了青蒿素的全合成途徑，其合成以R(+)──香草醛為原料，經(jīng)十幾步合成青篙素，合成途徑如圖21所示。國(guó)外也以不同原料為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行青篙素一類物的化學(xué)合成研究[3538]。圖21 青蒿素的化學(xué)合成途徑 Chemical synthesis pathways for Artemisinin 青蒿素的生物合成意義：（1）通過(guò)添加生物合成的前提來(lái)增加青蒿素的產(chǎn)量；（2）通過(guò)對(duì)控制青蒿素合成的關(guān)鍵酶進(jìn)行調(diào)控，或者對(duì)關(guān)鍵酶控制的基因進(jìn)行激活來(lái)大幅度增加青蒿素的含量；（3）利用基因工程手段來(lái)改變關(guān)鍵基因以增強(qiáng)他們可控制的酶的效率。青蒿素等倍半萜類的生物合成在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，途徑屬于植物類異戊二烯代謝途徑，可分為三大步：由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再內(nèi)酯化形成青蒿素。FPP→4,11二烯倍半萜→青蒿酸→二氫青蒿酸→二氧青蒿酸過(guò)氧化物→青蒿素。如圖22所示。目前在青蒿芽、青蒿毛狀根和青蒿發(fā)根農(nóng)桿菌等培養(yǎng)體系中進(jìn)行的青蒿素合成技術(shù)極有可能被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。青蒿素由于存在近期復(fù)燃性高、在油中和水中的溶解度低以及難以制成合適的劑型等不足，需對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以期在保持青蒿素優(yōu)良藥理作用基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新藥，進(jìn)一步改善和提高藥效。而合成青蒿素衍生物蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯、二氫青蒿素等克服了青蒿素復(fù)燃率高的弊病。①蒿甲醚。其抗瘧作用為青蒿素的10至20倍，目前其開(kāi)發(fā)成功的劑型蒿甲醚注射液為主要含蒿甲醚的無(wú)色或淡黃色澄明滅菌油溶液。②青蒿琥酯。是目前唯一的能制成水溶性制劑的青蒿素有效衍生物，給藥非常方便。作為抗瘧藥，不但效價(jià)高，而且不易產(chǎn)生耐受性。③雙氫青蒿素。比青蒿素有更強(qiáng)的抗瘧作用，它由青蒿素經(jīng)硼氫化鉀還原而獲得。圖22 青蒿素的生物合成途徑 Biosynthetic pathways for Artemisinin 植物組織培養(yǎng)合成青蒿素利用植物組織培養(yǎng)方法來(lái)生產(chǎn)青蒿素是目前青蒿素研究的另一熱點(diǎn)，可能成為大規(guī)模生產(chǎn)青蒿素的重要手段。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，已經(jīng)在青蒿愈傷組織、懸浮細(xì)胞、芽和毛狀根等培養(yǎng)體系中進(jìn)行了青蒿素的合成探究。1994年，秦明波等用發(fā)根農(nóng)桿菌1601成功轉(zhuǎn)化青篙幼莖獲得毛狀根培養(yǎng)物，提供了以發(fā)根農(nóng)桿菌作為基因載體進(jìn)行青篙的遺傳改造的可行性。與此同時(shí)，Weathers等用發(fā)根農(nóng)桿菌15834感染青篙的芽尖和葉片，獲得青篙毛狀根培養(yǎng)物，%，其含量遠(yuǎn)高于其它青篙組織培養(yǎng)物中青篙素的含量。蔡國(guó)秦等用發(fā)根農(nóng)桿菌1601感染青篙葉片建立了毛狀根培養(yǎng)系，并在培養(yǎng)物中檢測(cè)到青篙素，%。Vegruawe等利用根癌農(nóng)桿菌感染青蒿葉片，%，%，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行青篙素大量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 天然植物中提取青篙素除了化學(xué)合成、生物合成、植物組織培養(yǎng)制備青篙素以外，天然產(chǎn)物的提取也是一種簡(jiǎn)便高效的青篙素制備方法，尤其我國(guó)發(fā)展青篙素產(chǎn)業(yè)在資源方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。目前除黃花篙外，尚未發(fā)現(xiàn)含有青篙素的其它天然植物資源。黃花篙雖然系世界廣布種，但青篙素含量隨產(chǎn)地不同差異極大。據(jù)迄今的研究結(jié)果，除我國(guó)重慶東部、福建、云南、廣西、海南部分地區(qū)外，世界絕大多數(shù)地區(qū)生產(chǎn)的黃花篙中的青篙素含量都很低，無(wú)生產(chǎn)價(jià)值。因此，我國(guó)具有明顯的資源優(yōu)勢(shì)。所以，通過(guò)天然產(chǎn)物提取青篙素的各種方法，也就成為青篙素制備研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。如今，天然產(chǎn)物提取青篙素的方法包括有機(jī)溶劑提取、超亞臨界CO2萃取、微波萃取等方法。 黃花篙植物中青篙素的提取有機(jī)溶劑提取，青篙素易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于乙醇、乙醚，微溶于冷石油醚，幾乎不溶于水。因此可用有機(jī)溶劑提取植物中的有效成分，然后用柱層析或重結(jié)晶等方法分離精制得到青篙素。基本工藝是：干燥破碎浸泡、萃取（反復(fù)進(jìn)行）濃縮提取液粗品精制。 原料、設(shè)備及分析方法⑴ 實(shí)驗(yàn)原料：干青蒿葉末，將經(jīng)過(guò)篩選的青蒿葉置于烘箱中40℃烘烤3h后取出，用瓷乳缽研磨至粉狀，過(guò)篩，制成青蒿葉粉，儲(chǔ)于干燥器中備用。⑵ 主要試劑：青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma Chemical Co.，2℃儲(chǔ)存。試劑均為石油醚。⑶ 儀器分析：紫外分光光度法，Beckman DU7500紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)。 實(shí)驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定⑴冷浸提?。簻?zhǔn)確稱取青蒿樣品1g置紙筒中，置于反應(yīng)器中，加入石油醚浸泡，每24h更換一次溶劑，提取至溶劑無(wú)色。⑵恒溫?cái)嚢杼崛。涸戏湃脲F形瓶中，加入相應(yīng)比例的溶劑，以及攪拌轉(zhuǎn)子和沸石，安裝冷凝管，通入冷卻水后開(kāi)始攪拌并加熱，加熱過(guò)程中溫度控制在某一溫度下恒定。實(shí)驗(yàn)條件：青篙原料1g，石油醚溶劑量為60mL，置錐形瓶中，水浴溫度恒定為50℃，攪拌提取2h。⑶索氏提?。菏菍⒀屑?xì)的原料粉末放入濾紙筒內(nèi)，上下開(kāi)口處應(yīng)扎緊，以防粉末逸出。將其放入提取器的提取筒中，濾紙筒不宜太緊，以加大固體和液體的接觸面積。從提取管上口加入溶劑，當(dāng)發(fā)生虹吸時(shí)，液體流入燒瓶中，再補(bǔ)加過(guò)量溶劑。裝上冷凝管，通入冷卻水，加入沸石后開(kāi)始加熱。液體沸騰后開(kāi)始回流，在提取筒中蓄積，使粉末浸入液體中。當(dāng)液面超過(guò)虹吸管頂部時(shí)，蓄積的液體帶著從粉末中提取出來(lái)的易溶物質(zhì)流入燒瓶中。繼續(xù)使用上述方法，再進(jìn)行第二次提取。這樣重復(fù)多次以后，虹吸下的溶劑近無(wú)色。實(shí)驗(yàn)條件：青篙原料1g，加入60mL石油醚溶劑，置于索氏提取器中，水浴溫度恒定為500℃，提取2h。使用Soxhlet提取器來(lái)進(jìn)行提取。圖23 索氏提取裝置圖Fig23 Soxhlet extraction instruments⑷樣液處理：提取結(jié)束時(shí)，將提取液冷卻至室溫后，抽濾，濾液置于分液漏斗中，加入2% NaOH溶液洗去堿溶性部分，棄去下層堿液后，以蒸餾水洗滌至中性。經(jīng)水洗后的提取液置于圓底燒瓶中55℃減壓蒸餾，得到含青蒿素的浸膏，再以95%乙醇溶解浸膏，并定容于50mL容量瓶中備測(cè)。圖24 恒溫?cái)嚢杼崛⊙b置 Constant temperature reaction instruments⑸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精確稱取80℃干燥至恒重的青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品10mg置100mL容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度。分別吸取0，2，4，6，8，10mL于50mL容量瓶中，以95%乙醇補(bǔ)充至10mL，%NaOH溶液至刻度，置（50177。1）℃水浴中反應(yīng)30min，流水冷卻至室溫。在292nm處測(cè)吸光值。青蒿素濃度C可按下式計(jì)算：C= A+（mg/50mL）⑹ 樣品溶液的測(cè)定：吸取樣液2mL于20mL容量瓶中，補(bǔ)充95% 乙醇至4mL后，%NaOH溶液至刻度。50℃水浴中反應(yīng)30min后取出，流水冷卻至室溫。292nm處測(cè)吸收峰。青蒿素提取量M及提取回收率E的計(jì)算式如下：M=C247。50Vsn247。W0（mg/g）E=M247。M0100%其中：Vs=20mL，被測(cè)樣品體積；n=25，稀釋倍數(shù)；W0=1g，原料用量；A吸光度；M青蒿素提取量，mg/g；M0原料青蒿素含量，mg/g。 青篙素的分析測(cè)定方法 定性分析