【文章內(nèi)容簡介】 類與酶的催化活力無關(guān)，估計(jì)主要是利于分泌至胞外。同一類酶系中的不合糖類的酶組分，往往是結(jié)合在細(xì)胞膜上而很少分泌至胞外。加入表面活性劑，則有可能因改變細(xì)胞膜的通透性而獲得水解酶類的高產(chǎn)。 由于表面活性劑種類繁多，性質(zhì)各異，尚未有規(guī)律可循。如加入吐溫 80 可增加里氏木霉纖維素酶產(chǎn)量，但對(duì)其它菌株就末得到同樣效果。 8，篩選抗生素抗性突變株 抗生素種類繁多，其抑制微生物代謝的機(jī)制各不相同，一些主要抗生素的作用機(jī)制已比較清楚。篩選抗生素抗性突變體，也能取得由此而改變代謝調(diào)節(jié)，獲得過量生產(chǎn)的結(jié)果。 衣霉素可抑制細(xì)胞膜糖蛋白的生成。枯草桿菌的衣霉素抗性突變株的 α— 淀粉酶的產(chǎn)量較親株提高了 5 倍，研究結(jié)果表明，是由于分泌機(jī)制改變的結(jié)果?？估Ｆ降南灎钛勘U菌的無芽孢突變株的 β— 淀粉酶 產(chǎn)量提高了 7 倍，這是由于芽孢形成的延遲利于 β— 淀粉酶的形成，而抗利福平的突變株往往失去了形成芽抱的能力。谷氨酸捧桿菌的抗青霉素突變株的谷氨酸產(chǎn)量亦會(huì)增加。 對(duì)金屬離子的抗性和對(duì)有絲分裂的抑制劑抗性的突變株，也被用于改變細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)以 得到代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)。 9，選育條件抗性突變株 因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為“野生型”菌株的特性和突變型菌株特性的突變被稱為條件抗性 突變或稱為條件致死突變。其中溫度敏感型突變常被用于提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 適于在中溫條件下 (如 37℃ 左右 )生長的細(xì)菌，經(jīng)誘 變后可得到在較低溫度下生長而在較高溫度 (如 37℃ 以上 )不能生長的突變株，即溫度敏感型突變株。這是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后，在高溫條件下活力喪失的緣故。如此酶為蛋白質(zhì)、核苷合成途徑上的酶，則此突變株在高溫條件下的表型就是營養(yǎng)缺陷型。誘變處理乳糖發(fā)酵短桿菌，得到的溫度敏感突變株，在 30℃ 生長良好，在 32℃ 生長微弱，但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸，而野生型菌株卻受生物素的反饋抑制。在富含生物素的天然培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，可先在正常溫度下進(jìn)行培養(yǎng)以得到大量菌體，適當(dāng)時(shí)間后提高溫度，就能獲得谷氨酸的過量生產(chǎn)。經(jīng)多 次誘變后得到的高產(chǎn)菌株，往往是孢子形成能力減弱或喪失，這給保種傳代都帶來困難。篩選在低溫下能形成芽孢的溫度敏感突變株，就能解決此困難。 10，調(diào)節(jié)生長速率 在酶的誘導(dǎo)合成研究中發(fā)現(xiàn)，一些物質(zhì)具有誘導(dǎo)效應(yīng)及難被利用；與其只能維持較低的生長速率有關(guān)。而起阻遏作用的物質(zhì)則部是易被迅速利用和能維持高的生長速率。估計(jì)這是因?yàn)檎T導(dǎo)、阻遏的發(fā)生都與產(chǎn)能代謝有關(guān)而造成的。因此，改變培養(yǎng)條件如溫度、供氧量等以控制生長速率，也能獲得一定效果。 里氏木霉纖維素酶的大量合成是在菌體大量形成時(shí)，如控制它的比生長速率近于零 ，則能在一較長時(shí)間內(nèi)持續(xù)合成纖維素酶并獲得高產(chǎn)。 11， 加入酶的競爭性抑制劑 生物化學(xué)上把底物和抑制劑與酶相結(jié)合時(shí)呈現(xiàn)的互相排斥現(xiàn)象稱為競爭性抑制，即酶與抑制劑結(jié)合后就不能與底物相結(jié)合，反之亦然。 葡萄糖經(jīng)不完全氧化 (酵解 )生成丙酮酸，脫羧生成乙酰輔酶 A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)。乙酰輔酶 A 與草酰乙酸經(jīng)檸檬酸合成酶催化，把乙?；梢阴］o酶 A 轉(zhuǎn)移至草酰乙酸而成為檸檬酸。檸檬酸又因?yàn)躅^酸酶的存在而和它的異構(gòu)體順烏頭酸、異檸檬酸呈平衡。單氟乙酸在微生物細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏鷻幟仕?，此酸與烏頭酸酶有競爭性抑制， 因此，向培養(yǎng)基中加入單氟乙酸可導(dǎo)致檸檬酸的積累，減少異檸檬酸的生成。由此，篩選不能利用檸檬酸或?qū)畏? 乙酸敏感的突變襪，都達(dá)到了提高檸檬酸產(chǎn)量和減少異檸檬酸生成的結(jié)果。這些突變株的烏頭酸酶的活力都比較低。 二、提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法 次級(jí)代謝產(chǎn)物是指細(xì)胞生長不必需的、無明顯生理功能的微生物代謝產(chǎn)物。其結(jié)構(gòu)往往比較復(fù)雜，雖對(duì)產(chǎn)生菌的生長不是必需的，但在自然環(huán)境中對(duì)產(chǎn)生菌的存活還是有益的。從分子結(jié)構(gòu)上看，次級(jí)代謝產(chǎn)物可分為糖苷類、多肽類、?；悺⒑塑疹惣盎祀s類。它們均來自初級(jí)代謝產(chǎn)物，為其直接衍生物，或者 經(jīng)分子結(jié)構(gòu)上的修飾，或進(jìn)一步裝配、聚合而成。其合成過程遠(yuǎn)較初級(jí)代謝產(chǎn)物復(fù)雜。 初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成一般只需簡單的營養(yǎng)條件，在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中即可生成。而次級(jí)代謝產(chǎn)物則需要復(fù)雜的營養(yǎng)條件，往往需要供給營養(yǎng)成分復(fù)雜的天然物質(zhì)時(shí)才能形成。在各種條件下，初級(jí)代謝產(chǎn)物都能形成，而次級(jí)產(chǎn)物則往往僅在一特定培養(yǎng)條件下才能形成，尤其過量生產(chǎn)。在分批培養(yǎng)條件下，次級(jí)代謝產(chǎn)物一般都是在菌體生長的峰值出現(xiàn)后才大量合成。在發(fā)酵過程中如何使次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)入分化期，即次級(jí)代謝產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)或引發(fā)，是發(fā)酵工藝研究中的熱門之一。生理學(xué) 上的研究表明，在菌體生長峰值過后，培養(yǎng)基中可利用的 C、 N、 P、 S等主要元素已基本耗完，與這些原料的利用有關(guān)的酶活力趨于下降，與次級(jí)代謝產(chǎn)物形成有關(guān)的酶類逐漸出現(xiàn)。但是，菌體生長與產(chǎn)物合成兩個(gè)時(shí)期的劃分及相應(yīng)的這些生理特性的變化還取決于培養(yǎng)條件?！? 目前，次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)都還是沿用分批發(fā)酵方法，抗生素類的產(chǎn)物在此條件下又多為在菌體生長速率下降后才積累，但又難以長期持續(xù)合成。因此，通過控制培養(yǎng)條件以盡量 維持次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成期，亦是獲得過量生產(chǎn)的重要途徑。常用的提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法有以下幾種： 1，補(bǔ)加前體類似物 在合成途徑已基本清楚的條件下，向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加前體是增加次級(jí)產(chǎn)物的有效方法。如青霉素 G 的生產(chǎn)中，苯乙酰 — CoA 是限速性因子，補(bǔ)加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素 G 的產(chǎn)量。青霉素分子是 6APA 環(huán)形成后，再形成不同側(cè)鏈。加入不同的前體就可以得到不同種類的青霉索，補(bǔ)加苯氧乙酸即得到青霉素 V。多肽類和放線菌素類抗生索的合成中，也都能通過加入不同前體而得到不同種類的抗生素。這也可以稱之為定向合成 。 加入硝酸鹽可提高利福霉索的產(chǎn)量，其原因在于它抑制了脂肪酸的合成，使合成脂肪的前體丙二 酰 CoA 轉(zhuǎn)為利福霉素分子的脂肪環(huán)提供前體。 次級(jí)代謝產(chǎn)物形成中并不是所有前體類似物都是限制性因子。加入前體提高產(chǎn)量的效果更取決于總體代謝的調(diào)節(jié)水平。前體物質(zhì)本身是否易于得到等。這部是在生產(chǎn)應(yīng)用中需綜合考慮的。 2，加入誘導(dǎo)物 把一些對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生有誘導(dǎo)作用的物質(zhì)加入發(fā)酵培養(yǎng)基中會(huì)增加產(chǎn)量，如加蛋氨酸或硫脲可使頂頭孢霉增產(chǎn)頭孢霉素 C，加入巴比妥可提高利福霉素產(chǎn)量等。但在工業(yè)生產(chǎn)中還未普遍應(yīng)用此技術(shù)，而只是在選擇培養(yǎng)基組成時(shí)給以考慮。 3，防止碳分解代謝阻退或抑制的發(fā)生 青 霉索發(fā)酵中限量流加葡萄糖 (或糖蜜 )以減少碳分解阻遏的發(fā)生，早已是一項(xiàng)很有效的提高產(chǎn)量的方法。 使用寡糖、多糖等緩慢利用的碳源，葡萄糖與麥芽糖、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與淀粉混合碳源的利用，也都能減少碳分解阻遏的發(fā)生。 加入影響糖代謝的硫氰酸芐酯可使金霉菌對(duì)葡萄糖的利用速度減緩，可增加金霉素的產(chǎn)量。 4，防止氮代謝阻遏的發(fā)生 避免使用高濃度的銨鹽做氮源以防止氮代謝阻遏的發(fā)生，是抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中比較成熟的經(jīng)驗(yàn)。在抗生素產(chǎn)生期如補(bǔ)加氮源則會(huì)造成發(fā)酵逆轉(zhuǎn)，返回生長期，抗生素的產(chǎn)量會(huì)大為減少。 使用亞適量 (對(duì)菌體生長 )的磷酸鹽，亦是抗生素發(fā)酵工業(yè)中遵循的原則之一。 為防止碳、氮、磷分解阻遏的發(fā)生，應(yīng)選用黃豆餅粉、蛋白胨類、淀粉類物質(zhì)為主要原料，而盡量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 5，篩選耐前體或前體類似物的突變抹 加入前體有提高次級(jí)產(chǎn)物產(chǎn)量的效果；但過量對(duì)菌體又會(huì)有毒。篩選對(duì)前體育抗性的突變株以減少或消除前體的反饋?zhàn)瓒?，從而可獲得高產(chǎn)；如抗苯乙酸的青霉突變株，其青霉素的產(chǎn)量會(huì)增加。 半胱氨酸、纈氨酸是 內(nèi)酰胺類抗生素的前體，篩選上述氨基酸的類似物，三氟亮氨酸、DL纈氨酸的抗性菌株，其 β內(nèi)酰胺類抗生索產(chǎn)量會(huì)提高。 6，選育抗抗生素突變株 鏈霉素、氯霉素、金霉素籌多種抗生素都具有抑制產(chǎn)生自身菌體蛋白質(zhì)的能力。一株高產(chǎn)抗生索產(chǎn)生菌，必然應(yīng)具備對(duì)自身所分泌的抗生索的抗性。篩選抗抗生素產(chǎn)生菌也就成了菌種選育中的常用方法。金霉素、鏈霉素產(chǎn)生菌的抗性菌株產(chǎn)量有數(shù)倍增加的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果已有不少報(bào)道。 7，篩選營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株 次級(jí)代謝產(chǎn)物都來自初級(jí)代謝產(chǎn)物，因此其營養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)量一般都很低，但其回復(fù)突變型中卻有不少獲得高產(chǎn)的例子，其機(jī)制尚不 清楚，估計(jì)是次生產(chǎn)物或其前體合成的反饋抑制被解除。在金霉素產(chǎn)生菌選育中，運(yùn)用此方法曾獲得高產(chǎn)菌株。 8，抗毒性突變株的選育 重金屬離子、羥胺類物質(zhì)對(duì) β 內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生菌有毒，但與抗生素相結(jié)合可解毒。選擇適當(dāng)濃度的此類毒性物質(zhì)使其恰好抑制產(chǎn)生菌生長，在此條件下能生長的菌株，應(yīng)為抗生素類物質(zhì)過量產(chǎn)生的突變株。曾由頭孢霉素 C 對(duì)重金屬離子的抗性突變株中選育到高產(chǎn)菌株。 以上主要是從微生物的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制出發(fā)探討獲得代謝產(chǎn)物過量生產(chǎn)的方法。但是，微生物代謝產(chǎn)物特別是次級(jí)產(chǎn)物形成的途徑和調(diào)節(jié)控 制機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的，研究得比較清楚的只是少數(shù)。因此，上述方法的應(yīng)用往往也是經(jīng)驗(yàn)性的。 在生產(chǎn)實(shí)踐中為提高微生物產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)經(jīng)常使用的方法是誘變后隨機(jī)篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化。近年來運(yùn)用遺傳工程的方法以獲得代謝產(chǎn)物的過量生產(chǎn)是很活躍的研究領(lǐng)域。 三、高濃度微生物的培養(yǎng) 1，為什么要采用高濃度微生物的培養(yǎng)？ 微生物液體發(fā)酵大都采用分批培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式的缺點(diǎn)是：發(fā)酵液中最終細(xì)胞濃度不高。如果通過改進(jìn)工藝技術(shù)，使發(fā)酵液中微生物細(xì)胞增殖很高的濃度，那么，高濃度的細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生高濃度的發(fā)酵產(chǎn)物，這樣就可以大 大提高發(fā)酵設(shè)備的利用率，降低生產(chǎn)成本?；谶@種目的，人們開始研究微生物高細(xì)胞濃度的培養(yǎng)技術(shù)。采用高細(xì)胞濃度培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)酵液中菌體濃度比分批式培養(yǎng)可高 10 倍以上。 例如用高細(xì)胞濃度連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)大腸桿菌HBl01(pPAKS2)，可得到 95g／ L 的菌體。用同樣的方法培養(yǎng)酒精酵母可得到 219g／ L 的菌體。而一般用分批法培養(yǎng)酵母和細(xì)菌，得到的菌體濃度僅為 10g／ L 左右。 2，高細(xì)胞濃度培養(yǎng)技術(shù)的原理： 采用一定的工藝技術(shù)，保證微生物生長的適宜條件，延長微生物的指數(shù)增殖過程，從而得到高濃度的細(xì)胞。 3，高細(xì)胞濃度 培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) （ 1）可大大提高發(fā)酵設(shè)備的利用率 （ 2）節(jié)省能源 4，高濃度細(xì)胞培養(yǎng)的方法 （ 1）流加培養(yǎng) 要保持微生物生長的適宜環(huán)境條件以達(dá)到高菌體濃度，就必須采用恰當(dāng)?shù)牧骷友a(bǔ)料方式，補(bǔ)充生長所需的所有營養(yǎng)物。 因滲透壓的影響，在分批式培養(yǎng)中，不能靠過高地提高培養(yǎng)基濃度來獲取高濃度的細(xì)胞采用流加技術(shù)，可不斷地滿足菌體生長繁殖的需要，最終可以獲得高濃度的細(xì)胞。采用流加培養(yǎng)技術(shù)，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵過程的控制，如控制代謝途徑、菌體比生長速率等。這類技術(shù)還有一大優(yōu)點(diǎn)是，無需增添設(shè)備，只需改進(jìn)工藝就可以在生產(chǎn)上 廣泛應(yīng)用。流加培養(yǎng)技術(shù)還可解決以下問題： 底物抑制 ：在許多發(fā)酵過程中，某些底物如乙醇和苯環(huán)類化合物，只有在低濃度情況下，才不抑制菌體的生長。在分批培養(yǎng)中，若提高這些底物的濃度，就會(huì)出現(xiàn)底物對(duì)生長的抑制。而在發(fā)酵過程中流加這類底物，控制它們?cè)诎l(fā)酵液中的濃度，使之一方面能不斷滿足菌體生長的需要，另一方面又不會(huì)抑制菌體的生長，這樣，底物抑制就能被消除。 分解代謝阻遏 ：如果微生物利用葡萄糖等易于代謝的碳源，代謝產(chǎn)生的物質(zhì)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸濃度降低，造成某些酶終止合成，這種現(xiàn)象稱分解代謝阻遏。在流加培養(yǎng)過程中，緩慢 流加這種碳源，可消除分解代謝阻遏作用。 葡萄糖效應(yīng) ：培養(yǎng)面包酵母時(shí)，存在一臨界葡萄糖濃度，培養(yǎng)基中葡萄糖高于此濃度時(shí)，會(huì)部分代謝成乙醇，甚至在有充足溶解氧的條件下也會(huì)產(chǎn)生乙酵，此現(xiàn)象稱葡萄糖效應(yīng)。采用流加技術(shù)，可以控制葡萄糖濃度在此臨界濃度以下，這樣就可以防止乙醇產(chǎn)生，得到高濃度的面包酵母。 為了實(shí)現(xiàn)需氧微生物的高濃度培養(yǎng)，需要一個(gè)能供給大量氧氣的高性能發(fā)酵罐。溶解氧濃度 [DO]需要保持在每升幾個(gè)微克以上，但也不能過高。大體上應(yīng)該保持在 109g／ L 以下。不過，需氧微生物培養(yǎng)中，最容易缺乏的營養(yǎng)物仍然是 [DO]。完全可以說 [DO]是高菌體濃度培養(yǎng)生長速率的控制因素。 碳源是最重要的營養(yǎng)物，要用恰當(dāng)?shù)姆绞阶詣?dòng)流加。氮源可結(jié)合 pH控制與碳源一起流加，并利用氨氣傳感器或銨離子選擇電極等實(shí)行自動(dòng)流加控制。微生物生長至少需要十幾種無機(jī)離子，很難對(duì)這么多離子的濃度進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，因而無法對(duì)其濃度進(jìn)行反饋控制，可以與碳源或氮源同時(shí)自動(dòng)流加。加料流量根據(jù)物料衡算確定，所有營養(yǎng)物都可通過計(jì)算機(jī)控制自動(dòng)流加。 流加培養(yǎng)的控制方式 無反饋控制 ? 恒速流加 ? 變速流加 ? 指數(shù)流加 反饋控制 ? DO恒定控制 pH恒定控制 CO2 生成速率控制 細(xì)胞濃度控制 底物濃度控制 （ 2）高細(xì)胞濃度連續(xù)培養(yǎng) 原理： 無菌培養(yǎng)基以一定速度連續(xù)補(bǔ)入發(fā)酵液，同時(shí)采用離心。膜過濾等方法，回收排出液中的細(xì)胞，使之重新進(jìn)入發(fā)酵液中，這樣微生物就可以在發(fā)酵液中高濃度地積累。高濃度的細(xì)胞產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物，這些產(chǎn)物隨排出液排出進(jìn)入提取過程，同時(shí)對(duì)細(xì)胞生長起抑制作用的代謝產(chǎn)物也被排出。 除去抑制物質(zhì)的方法： 透析培養(yǎng)：通過半透膜使培養(yǎng)液與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)液中的