【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 程中菌體的生長(zhǎng)，發(fā) 酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的關(guān)系。把它們隨時(shí)間變化的過(guò)程繪制成圖，就成為所說(shuō)的代謝曲線。 發(fā)酵過(guò)程按進(jìn)行過(guò)程有三種方式： （ 1）分批發(fā)酵 (Batch fermentation) （ 2）補(bǔ)料分批發(fā)酵 (Fedbatch fermentation) （ 3）連續(xù)發(fā)酵 (Continuous fermentation) 本節(jié)主要介紹分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵三種類型的操作方式下的代謝特征。 一、分批發(fā)酵 分批發(fā)酵的定義 是指在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式 。在這一過(guò)程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基成分減少，微生物得到繁殖。 分批發(fā)酵的特點(diǎn) 微生物所處的環(huán)境在發(fā)酵過(guò)程中不斷變化，其物理，化學(xué)和生物參數(shù)都隨時(shí)間而變化，是一個(gè)不穩(wěn)定的過(guò)程。 分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)單； 操作引起染菌的概率低。 不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題 缺點(diǎn)： 非生產(chǎn)時(shí)間較長(zhǎng)、設(shè)備利用率低。 分批發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線 單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)曲線 （ 2）絲狀真菌的生長(zhǎng)曲線 在液體振蕩培養(yǎng) (或深層通氣培養(yǎng) )中， 以菌絲干重作為衡量生長(zhǎng)的指標(biāo)，可獲得如圖所示的生長(zhǎng)曲線。在靜止培養(yǎng)中也可獲得類似的生長(zhǎng)曲線。 絲狀真菌的生長(zhǎng)過(guò)程大致可分為；①生長(zhǎng)延滯期；②迅速生長(zhǎng)期；③衰退期。 ①生長(zhǎng)延滯期 造成生長(zhǎng)延滯的原因有兩種：一是孢子萌發(fā)前的真正的延滯期，另一種是生長(zhǎng)已開(kāi)始但卻無(wú)法測(cè)量。對(duì)真菌的生長(zhǎng)延滯期尚未作過(guò)仔細(xì)研究。 ②迅速生長(zhǎng)期 此時(shí)菌絲體干重迅速增加，其立方根與時(shí)間成直線關(guān)系。因?yàn)檎婢皇菃渭?xì)胞，其繁殖不以幾何倍數(shù)增加，故而沒(méi)有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。真菌的生長(zhǎng)常表現(xiàn)為菌絲尖端的生長(zhǎng)和菌絲的分枝，因此受到鄰近細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)的影響。尤其在靜止培養(yǎng)時(shí)，許多菌絲在空氣中生長(zhǎng)，必須從鄰近的細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供生長(zhǎng)需要，在迅速生長(zhǎng)期中，碳、氮、磷被迅速利用，呼吸強(qiáng)度達(dá)到頂峰，代謝產(chǎn)物如酸類可出現(xiàn)或不出現(xiàn)。靜止培養(yǎng)時(shí)，在迅速生長(zhǎng)期的后期的菌膜上格出現(xiàn)孢子。 ③衰退期 真菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期的標(biāo)志，是菌絲干重下降。一般是在一短期內(nèi)失重很快，以后不再變化。但有些真菌則發(fā)生菌絲體自溶，由于其自身所產(chǎn)生的酶類催化幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等分解而釋放出氨、游離氨基酸、有機(jī)磷化物和有機(jī)硫化合物等。處于衰退期的菌絲體的細(xì)胞，除頂端較幼細(xì)胞的原生質(zhì)比較稠密均勻 外，大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)大的空泡。 生長(zhǎng)的停止由以下兩種因素之一所決定。在高濃度培養(yǎng)基中，可能是因?yàn)橛卸敬x產(chǎn)物的積累而阻礙生長(zhǎng)，如在高濃度碳水化合物的培養(yǎng)基中可積累有機(jī)酸；在含有機(jī)氮高的培養(yǎng)基中可積累氨。多數(shù)次生物質(zhì)，如抗生素等，也是在此時(shí)合成的。在較稀釋的、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)平衡良好的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)停止的主要因素是碳水化合物的耗盡。當(dāng)生長(zhǎng)停止后，菌絲體的自溶裂解的程度，因菌種的本性和培養(yǎng)條件而導(dǎo)。 分批發(fā)酵的類型 通常有兩種分類方式： （ 1） Gaden39。s fermentation classification（按照菌體生長(zhǎng)，碳源利用和產(chǎn)物生成的變化） ①第一類型（生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型） 產(chǎn)物直接來(lái)源于產(chǎn)能的初級(jí)代謝（自身繁殖所必需的代謝），菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成不分開(kāi)（見(jiàn)下圖）。例如單細(xì)胞蛋白和葡萄糖酸的發(fā)酵。 其動(dòng)力學(xué)方程為： ②第二類型（部分生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型） 產(chǎn)物也來(lái)源于能量代謝所消耗的基質(zhì)，但產(chǎn)物的形成在與初級(jí)代謝分開(kāi)的次級(jí)代謝中，出現(xiàn)兩個(gè)峰，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，出現(xiàn)產(chǎn)物形成高峰（見(jiàn)下圖）。例如，檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵。 其動(dòng)力 學(xué)方程為 ③第三類型 產(chǎn)物是在基質(zhì)消耗和菌體生長(zhǎng)之后，菌體利用中間代謝反應(yīng)來(lái)形成的，即產(chǎn)物的形成和初級(jí)代謝是分開(kāi)的（見(jiàn)下圖）。如抗生素發(fā)酵。 其動(dòng)力學(xué)方程為： （ 2） Piret39。s fermentation classification （按照產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)是否同步） ①生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 (第一類型 ) 形成與生長(zhǎng)有關(guān)，如酒精、某些酶等。 ：產(chǎn)物合成的比速率菌體）產(chǎn)物成比例（：生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型產(chǎn)物的形或PX d tdPPdtdPggx/???????????????????XdtdPPdtdPQ XX?????XdtdPPdtdPQ X 其動(dòng)力學(xué)方程為： ②生長(zhǎng)無(wú)關(guān)聯(lián)型（第二，三類型） 產(chǎn)物的形成速度與生長(zhǎng)無(wú)關(guān)，只與細(xì)胞積累量有關(guān)。如，抗生素。 殺念珠菌素發(fā)酵中葡萄糖、 DNA、抗生素產(chǎn)量的代謝變化 A： DNA； B：葡萄糖； C：殺念珠菌素產(chǎn)量 6，分批發(fā)酵的分類對(duì)實(shí)踐的指導(dǎo)意義 從上述分批發(fā)酵類型可以分析：如果生產(chǎn)的產(chǎn)品是生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型（如菌體與初級(jí)代謝產(chǎn)物），則宜采用有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件，延長(zhǎng)與產(chǎn)物合成有關(guān)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；如果產(chǎn)品是非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型（如次級(jí)代謝產(chǎn)物），則宜縮短對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并迅速獲得足夠量的菌體細(xì)胞后延長(zhǎng)平衡期，以提高產(chǎn)量。 7，典型的分批發(fā)酵工藝流程 ）：比生長(zhǎng)速率（）物的率（：菌體生長(zhǎng)為基準(zhǔn)的產(chǎn)）產(chǎn)物形成比速率（hYQYQggLhgxPPxPP1////:?????? 二、補(bǔ)料分批 發(fā)酵 定義 補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過(guò)程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 補(bǔ)料分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度； 和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴(yán)格的無(wú)菌條件； 不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題。 缺點(diǎn)： 存在一定的非生產(chǎn)時(shí)間； 和分批發(fā)酵比，中途要流加新鮮培養(yǎng)基，增加了染菌的危險(xiǎn)。 補(bǔ)料分批發(fā)酵的類型 按補(bǔ)料方式不同可分為： （ 1）連續(xù)流加 （ 2）不連續(xù)流加 （ 3）多周期流加 按補(bǔ)料成分的不同可分為： （ 1）單一組 分流加 （ 2）多組分流加 按控制方式的不同可分為： （ 1）反饋控制 （ 2）無(wú)反饋控制 四、連續(xù)發(fā)酵 定義 培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時(shí)放出含有產(chǎn)品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度、恒定的 pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長(zhǎng)速率）下生長(zhǎng)的發(fā)酵方式。 連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 能維持低基質(zhì)濃度； 可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量； 便于自動(dòng)控制。 缺點(diǎn)： 菌種發(fā)生變異的可能性較大； 要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件。 連續(xù)發(fā)酵 的類型 （ 1）恒化培養(yǎng) 使培養(yǎng)基中限制性基質(zhì)的濃度保持恒定 （ 2）恒濁培養(yǎng) 使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定 連續(xù)發(fā)酵的代謝曲線 X：菌體濃度； S：限制性基質(zhì)濃度； t：時(shí)間 第二節(jié) 發(fā)酵工藝的控制 工藝條件控制的目的：就是要為生產(chǎn)菌創(chuàng)造一個(gè)最適的環(huán)境，使我們所需要的代謝活動(dòng)得以最充分的表達(dá)。 一、溫度對(duì)發(fā)酵的影響及控制 1，影響發(fā)酵溫度的因素 （ 1）產(chǎn)熱因素：生物熱和攪拌熱。 （ 2）散熱因素：蒸發(fā)熱和輻射熱。 2，發(fā)酵熱 發(fā)酵熱就是發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量。 Q 發(fā) 酵 =Q 生物 +Q 攪拌 Q 蒸發(fā) Q 輻射 （ 1）生物熱： 定義：生物熱是生產(chǎn)菌在生長(zhǎng)繁殖時(shí)產(chǎn)生的大量熱量。培養(yǎng)基中碳水化合物，脂肪，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被分解為 CO2,NH3 時(shí)釋放出的大量能量。 用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動(dòng)，熱能散發(fā)。 影響生物熱的因素：生物熱隨菌株，培養(yǎng)基，發(fā)酵時(shí)期的不同而不同。一般，菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的速率越大，培養(yǎng)基成分越豐富，生物熱也就越大。發(fā)酵旺盛期的生物熱大于其他時(shí)間的生物熱。生物熱的大小還與菌體的呼吸強(qiáng)度有對(duì)應(yīng)關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗生素高產(chǎn)量批號(hào)的生物熱高于低產(chǎn)量批號(hào)的生物熱。說(shuō) 明抗生素合成時(shí)微生物的新陳代謝十分旺盛。 發(fā)酵過(guò)程中生物熱的變化 在四環(huán)素發(fā)酵中，還發(fā)現(xiàn)生物熱和菌的呼吸強(qiáng)度的變化有對(duì)應(yīng)關(guān)系，特別是在 80小時(shí)以前。從此實(shí)驗(yàn)中還可看到，當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時(shí)，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可從菌體的耗氧率來(lái)衡量生物熱的大小。 四環(huán)素生物合成過(guò)程中系列參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程 1：效價(jià)； 2：呼吸強(qiáng)度； 3：生物熱； 4：糖濃度 （ 2）攪拌熱 定義：通風(fēng)發(fā)酵都有大功率攪拌，攪拌的機(jī)械運(yùn)動(dòng)造成液體之間，液體與設(shè)備之間的摩 擦而產(chǎn)生的熱 。 攪拌熱的計(jì)算： Q 攪拌 =3600（ P/V） 式中 3600：熱功當(dāng)量（ kJ/（ ）） 抗生素相對(duì)活性為 1 抗生素相對(duì)活性為 （ P/V）：通氣條件下單位體積發(fā)酵液所消耗的功率（ kW/m3） （ 3）蒸發(fā)熱 定義：通入發(fā)酵罐的空氣，其溫度和濕度隨季節(jié)及控制條件的不同而有所變化?？諝膺M(jìn)入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進(jìn)行熱交換。同時(shí)必然會(huì)引起水分的蒸發(fā)；蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。 蒸發(fā)熱的計(jì)算： Q 蒸發(fā) =G（ I2I1） 式中 G：空氣流量，按干重計(jì)算， kg/h I1 、 I2 ：進(jìn)出發(fā)酵 罐的空氣的熱焓量， J/kg（干空氣） （ 4）輻射熱 定義：由于發(fā)酵罐內(nèi)外溫度差，通過(guò)罐體向外輻射的熱量。 輻射熱的計(jì)算：輻射熱可通過(guò)罐內(nèi)外的溫差求得，一般不超過(guò)發(fā)酵熱的 5%。 3，發(fā)酵熱的測(cè)定 （ 1）通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水進(jìn)出口溫度，由下式求得這段時(shí)間內(nèi)的發(fā)酵熱。 （ 2）通過(guò)罐溫的自動(dòng)控制，先使罐溫達(dá)到恒定，再關(guān)閉自控裝置測(cè)得溫度隨時(shí)間上升的速率 S，按下式可求得發(fā)酵熱： 4，溫度對(duì)發(fā)酵的影響 溫度通過(guò)以下方式影響發(fā)酵過(guò)程 （ 1）影響各種酶的反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)性 質(zhì) （ 2）影響發(fā)酵液的物理性質(zhì) （ 3）影響生物合成的方向。例如，四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時(shí)能產(chǎn)生金霉素。在低于 30℃溫度下，該菌種合成金霉素能力較強(qiáng)。當(dāng)溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高。在溫度達(dá) 35℃則只產(chǎn)生四環(huán)素而金霉素合成幾乎停止。 發(fā)酵過(guò)程中，微生物生長(zhǎng)速率變化 dX/dt =μ Xα X 式中 μ：比生長(zhǎng)速率 α：比死亡速率 當(dāng)處于生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，μ α，α可忽略。 μ與 α與溫度有關(guān) 根據(jù) Arrenhnius 公式 μ = AeE/RT α = A’eE’/RT 通常 E’大于 E，所以 α比 μ對(duì)溫度變化更為敏感。 例：青霉菌生產(chǎn)青霉素 青霉菌生長(zhǎng)活化能 E=34kJ/mol 青霉素合成活化能 E=112kJ/mol 青霉素合成速率對(duì)溫度較敏感，溫度控制相當(dāng)重要。 5，最適溫度的確定 在發(fā)酵過(guò)程中，最適溫度是一種相對(duì)概念，是指在該溫度下最適于菌的生長(zhǎng)或發(fā)酵產(chǎn)物的生成。最適發(fā)酵溫度與菌種，培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段有關(guān)。 最適發(fā)酵溫度的選擇：在發(fā)酵的整個(gè)周期內(nèi)僅選一個(gè)最適培養(yǎng)溫度不一定好。溫度的選擇要參考其它發(fā)酵條件。溫度的選擇還應(yīng)考慮培養(yǎng)基成分和濃度 6， 溫度的控制 發(fā)酵罐：夾套（ 10M3 以下） 盤管（蛇管） （ 10M3 以上） 二、 pH 對(duì)發(fā)酵的影響及控制 發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)液的 pH 值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)。它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)品的積累有很大的影響。因此，必須掌握發(fā)酵過(guò)程中 pH 的變化規(guī)律，及時(shí)監(jiān)測(cè)并加以控制，使它處于最佳的狀態(tài)。盡管多數(shù)微生物能在 3~4 個(gè) pH 單位的 pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但是在發(fā)酵工藝中，為了達(dá)到高生長(zhǎng)速率和最佳產(chǎn)物形成，必須使 pH 在很窄的范圍內(nèi)保持恒定。 1， pH 值對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物 合成的影響 pH 通過(guò)以下方式影響發(fā)酵過(guò)程： （ 1） pH 影響