【正文】 替代致癌性試驗 陽性對照 ? 目前每個實驗中都需要一個陽性對照以確認模型的易感性 ? 通常使用明顯誘變致癌物 對于 rasH2來說一般是 MNU或 尿烷 對 Trp53來說一般是 p甲酚啶 或 MNU或 尿烷 MNU組或尿烷組一般 1015只 /性別 僅檢查靶器官（ FDA） MNU：胸腺淋巴瘤（ 8090%），前胃乳頭瘤和癌 尿烷：支氣管腫瘤，血管肉瘤 p甲酚啶：膀胱上皮腫瘤 替代致癌性試驗 劑量選擇 ? 最大耐受劑量 死亡率升高 相對于對照組，體重增加值減少 ≥10% 顯著的靶器官毒性 降低預(yù)期壽命的臨床病理學(xué)發(fā)現(xiàn) ? 最大可行劑量 ? 最大暴露 ? 限定劑量（ 1500 mg/kg）？ ? 非無毒的人體暴露量的倍數(shù) 替代致癌性試驗 FDA審查 ? 在劑量范圍確定之前，通知審查部門打算使用致癌性替代模型 ? FDA致癌性咨詢委員會將劑量選擇及研究設(shè)計，基于以下幾點： 用該該模型的理由 確定劑量范圍研究的 TK數(shù)據(jù) 遺傳毒性信息 小鼠和人體代謝數(shù)據(jù) 藥物及代謝物在人體的暴露數(shù)據(jù) 為“可靠”的兩年大鼠試驗所作的實驗設(shè)計 ? 替代動物模型幾乎總被接受（除了 PPAR拮抗劑） 替代致癌性試驗 病理終點 ? 通常不評價臨床病理學(xué) ? 無需器官稱重 ? 全組織采樣 ? 除了陽性對照組出現(xiàn)的靶器官外，所有處理組中的所有組織都進行顯 微檢查（有些檢查對照組，高劑量組及靶器官） ? 病理同行評審 —具有代表性的處理動物的所有靶器官的腫瘤 ? 對腫瘤統(tǒng)計分析 替代致癌性試驗 提交給 FDA的替代模型試驗 模型 已接收的試驗 陽性結(jié)果的試驗 Trp 53+/ 31 2 XPA/ p53 +/ 1 不充分的 0 Tg. AC 16 1 不充分的 5 Neonatal 1 遺傳毒性 0 rasH2 13 2 Note: 摘自 Abigail Jacobs的報告 , FDA, CDER, 2023 替代致癌性試驗 轉(zhuǎn)基因小鼠的優(yōu)勢 模型 傳統(tǒng)的 轉(zhuǎn)基因的 研究期限 2年 6個月 從開始到提交最終報告 4年 動物數(shù) 400 230 花費 $3M $1M 2023/1/16 104 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。 基本的實驗設(shè)計 組別 劑量（ mg/kg） 動物 中期剖檢 毒代 1 對照組 * 0 64M/64F 10M/10F 4M/4F 2 低劑量組 X 64M/64F 10M/10F 4M/4F 3 中劑量組 Y 64M/64F 10M/10F 4M/4F 4 高劑量組 Z 64M/64F 10M/10F 4M/4F 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 ―最高劑量或最大耐受劑量用來預(yù)測在致癌性試驗過程中會產(chǎn)生的最低毒性作用” ICH S1C(R2) 在最高推薦人用劑量時，嚙齒類與人類血清 AUC（無毒藥物）的暴露比大于 25:1 吸收飽和 — 最大暴露 限制劑量藥理學(xué) — 鎮(zhèn)靜，食欲不振，血壓過低，影響實驗數(shù)據(jù)的癲癇 如果以下情況發(fā)生，采用限制劑量（藥物）： 1500 mg/kg 人用劑量 500 mg/d；無遺傳毒性；暴露水平高于最高推薦人用劑量的 10倍 最大可行劑量 飼料量的 5%；最大灌胃量；局部耐受性 高劑量的選擇 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 展示不同劑量組藥物代謝動力學(xué)、藥理學(xué)、毒理和致癌性范圍 —各組間暴露不同很重要 展示不產(chǎn)生毒性或未出現(xiàn)藥物相關(guān)腫瘤的劑量水平（定義閾值） 通常使用給藥劑量或人類暴露的幾何或線性倍數(shù) 通常低劑量接近臨床暴露水平 低劑量和中劑量的選擇 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 對于藥品， FDA的 CAC特別提出了一套評估方案，包括 給藥原理 和實驗設(shè)計 客戶必須提交與實驗計劃給藥途徑一致的 預(yù)試驗結(jié)果 ，此外還需提交遺傳毒理學(xué)數(shù)據(jù)，人類給藥和暴露劑量，蛋白結(jié)合信息，人體和動物中代謝物的數(shù)據(jù) 在試驗開始前，無任何其他機構(gòu)定期審查方案 如果 FDA與客戶意見一致或客戶同意接受美國 FDA的建議，無論研究結(jié)果如何， FDA都認為劑量的選擇適當(dāng) 美國 FDA致癌評估委員會（ CAC） 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 毒理學(xué)監(jiān)測 攝食量 體重 臨床癥狀 六個月后進行觸診腫塊，一般每周一次，但可以低于此頻率。 三色 FCM自動化 MN檢測系統(tǒng)符合IWGT的標準 FCM體內(nèi)微核自動化檢測 基本滿足分子生物學(xué)和組合化學(xué)的大量候選化合物的毒性篩選 快速、高通量 靈敏、客觀 機制研究 無種屬選擇性 三色 FCM vs 顯微鏡檢 ? 既可以檢出染色體斷裂劑，也可以檢出非整倍體誘導(dǎo)劑； ? 研究量效關(guān)系和毒性閾值。 小鼠淋巴瘤細胞試驗（ MLA） 一般認為大、小集落突變體是由于基因損傷的范圍和程度不同所致。 但 TFT的作用比 BUdR更迅速 ， TFT在一個細胞世代即可阻滯 tk+/ 細胞 ， 因此 TFT選擇平板背景清晰；而 BUdR則需要經(jīng)歷數(shù)個細胞世代才能完全阻滯 tk+/ 細胞 ，故可產(chǎn)生分散的微小集落 （ microcolony） ， 形成特征性的背景陰影 （background haze） 。 Ames試驗 代謝活化系統(tǒng) ?大鼠肝 S9混合液 ?S9制備方法：取 5只雄性大鼠，處死大鼠的前 5天單次腹腔注射給予 500 mg/kg的 Aroclor 1254。 Ames試驗 預(yù)培養(yǎng)法 將下列物質(zhì)在冰浴上混合： mL S9混合液或 mL磷酸緩沖液 （大約 10^8菌量） mL受試物溶液（或?qū)φ?，溶劑和陽性對照物溶液? 將該混合液在 37℃ 下培養(yǎng) 20分鐘（水浴中） 然后加入 2mL含有 ％瓊脂、 ％ NaCl、 mM生物素和 L－ 組胺酸的融溶頂層培養(yǎng)基，鋪至基礎(chǔ)培養(yǎng)瓊脂表面（ VB培養(yǎng)基 E），在 室溫下凝固。 二者均為胸苷類似物 ， 都能被胸苷激酶磷酸化 ， 其磷酸化產(chǎn)物摻入 DNA 可導(dǎo)致 tk+/ 細胞死亡 。 ?微孔平板法：大集落 ≥ 微孔直徑的 1/4 小集落＜微孔直徑的 1/4 ?軟瓊脂平皿法：大集落直徑 ≥ 小集落直徑＜ ?大集落呈彌散性生長，其密度低；小集落呈集中性生長，其密度高。 A B C D FCM與常規(guī)顯微鏡檢 MN結(jié)果相關(guān)性良好，同時獲得 3個指標： %RET、 %MNRET和 %MNNCE； 染色體斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑都能檢測出來； 重復(fù)性好，同樣的受試物劑量在本實驗室和其他已知報道的實驗室結(jié)果相當(dāng)； 排除一些假陽性因素的干擾 : ? 使用 RNase，排除 聚集 RNA的干擾； ? 使用 CD61抗體，排除 血小板 的干擾； ? 使用 CD71抗體特異標記 RET，排除常規(guī) Giemsa同染的 嗜堿性小體 等干擾。同時，需要用主實驗的動物或獨立 的 TK組動物進行 TK實驗進行