【正文】 ? 歐洲認(rèn)可 Trp53+/模型來評價非遺傳毒性物質(zhì) ? rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠 攜帶一些帶有啟動子的人類正常 ras基因插入拷貝。每周觸診 可以對腫瘤的發(fā)病提供更好的評估 對瀕死的動物實行安樂死，早期處死要比晚期死亡更有價值 預(yù)先設(shè)定好安樂死標(biāo)準(zhǔn)將加速決策進程 活體數(shù)據(jù)采集 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 每個實驗中藥物的暴露情況都必須進行評估 在實驗中 第 612個月 對暴露情況評估一次就足夠了 通常取 34個時間點 ，每個劑量組每個時間點取 34只動物 進行 如果用主實驗的動物，每只大鼠取一個樣品；對于小鼠用衛(wèi)星動物組 收集和分析對照組的樣品 期望有獨立的毒代動力學(xué)報告 毒代動力學(xué) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 醫(yī)藥品通常不進行臨床病理的檢驗，除非有項目特殊要求（ STP, in press 2023） 實驗終期進行臨床病理檢測沒有價值，而中期處死時進行卻很有價值 如果在實驗早期沒有將臨床病理檢查定義好，在 15個月內(nèi)也可以考慮進行特定的檢查 血涂片和骨髓涂片是否要進行常規(guī)采集？ 可以作為保險措施 通常不進行 根據(jù)情況而定 臨床病理學(xué) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 在全面評價潛在致癌性研究時統(tǒng)計學(xué)是一個重要的工具 控制假陽性錯誤 對罕見腫瘤 P 對常見腫瘤 P 專題負責(zé)人必須監(jiān)測活體階段所有初步假設(shè)的統(tǒng)計因素，并減少偏離 對死亡率、腫塊、大體和組織病理學(xué)數(shù)據(jù)的評估是十分復(fù)雜的 * 來自活體階段人員以及病理專家的數(shù)據(jù)要準(zhǔn)確完整 足夠的死亡率（到 80~90周時尚有 50%） 早期處死瀕死動物以保存組織 跟蹤活體階段表明腫瘤 確定可能的死亡原因 *見指導(dǎo)原則 《 藥物慢性嚙齒類致癌試驗的設(shè)計，分析和闡釋中的統(tǒng)計學(xué) 》 , FDA CDER, 2023 統(tǒng)計分析應(yīng)考慮的因素 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 每層架子上的各組動物數(shù)目相等 定期在房間內(nèi)交替架子，以減少視網(wǎng)膜退變 在非工作時間，采用低光照以減少視網(wǎng)膜退變 給藥順序：對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組； 避免交叉污染 以同樣順序來采集毒代樣品 高標(biāo)準(zhǔn)的動物管理是至關(guān)重要的 保持同樣的飼料 /墊料來源，密切監(jiān)測成分 /污染物的變化 活體期間動物的飼養(yǎng)與管理 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 如果死亡率很高，可能一個劑量組全部早期處死更合適 FDA在通訊中提到： 在第 100周以前，幸存動物數(shù)降至 15時，可考慮處死該給藥組或該性別所 有動物 在某些方案中，當(dāng)幸存動物數(shù)降至 20時，停止對高劑量組該性別動物的 給藥；當(dāng)幸存動物降至 15時，處死高劑量組受影響的性別的所有動物 如果對照組的幸存動物數(shù)下降至 20或更少時，處死所有劑量組中受影響 的性別的所有動物 在 100周以后，如果高劑量組的幸存動物降至 15時，處死所有劑量組中受 影響的性別的所有動物 早期處死一個劑量組不會實驗無效 劑量組的提前終止 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 早期處死與早期死亡 所有組織采集 早期處死動物比發(fā)現(xiàn)死亡動物更有價值 大鼠品系的選擇會影響動物的壽命和到計劃處死時存活的比例 Wistar大鼠存活率比 SD大鼠高 腫塊跟蹤 跟蹤活體階段的每一個腫塊 與解剖結(jié)果的關(guān)聯(lián) 通過顯微評價來跟蹤解剖時發(fā)現(xiàn)的腫塊（ Peto試驗要求） 解剖 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 檢查方案中各組所有動物的所有組織和腫塊 跟蹤解剖中發(fā)現(xiàn)的所有腫塊的顯微診斷 盡可能將大體觀察與顯微觀察結(jié)果關(guān)聯(lián)起來；但是 “大體觀察與顯微觀察沒有關(guān)聯(lián)” 也是可接受的，不是每個大體觀察都有相關(guān)聯(lián)的顯微觀察，重要的是你所觀察到的。 大鼠 因為 SD大鼠的死亡率高，所以每組動物數(shù)量要多（ 70只 /性別 /組） Wistar和 F344大鼠存活率高些，但 F344漸漸不受歡迎 Wistar大鼠用的越來越多， 50只 /性別 /組 小鼠 CD1和 B3C6F1在兩年致癌性試驗中較常用 種屬和品系的選擇 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 1個溶劑對照組， 3個給藥組 至少 50只 /性別 /組，可考慮增加（如： 70只 /性別 /組） 中期處死 毒代樣品采集 其他血樣采集 兩年存活率低 （終身試驗）計劃給藥 104周 理想情況下，在計劃處死時能有 25只 /性別 /組 以計劃用于臨床的給藥方式給藥；環(huán)境化學(xué)品、人用食品添加劑或動 物飼料補充劑等加入飲食中。 嚙齒類骨髓和外周血；其他骨髓樣品不易獲取且脾臟亦有消除 MNRBC作用的物種的 MN檢測 （狗、靈長類等） FCM亦能得出 MN大小和分布的資料，即 PI相關(guān)的熒光數(shù)值的大?。ㄈ?DNA含量） FCM體內(nèi)微核自動化檢測 S2R1推薦的試驗方法 體內(nèi) Comet試驗 體內(nèi) Comet 試驗 遺傳毒性新方法的研究 體內(nèi) Piga基因突變試驗 Piga是 N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化亞基的編碼基因， N—乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶催化細胞表面磷脂酰肌醇聚糖（ glycosylphosphatidylinositol, GPI）錨的早期合成， GPI錨可將一些特殊的蛋白（如 CD5 CD48等）連接到細胞表面。（微孔法中的GEF=99+27=126） 陽性對照參考值 ? 其一，陽性對照組總誘導(dǎo)率IMF至少 ≥300 106，其中小克隆 IMF至少 ≥120 106 ? 其二，小克隆 IMF至少≥150 106 ? 滿足上述標(biāo)準(zhǔn)之一，并且陽性對照相對總生長率 （ RTG） ≥10% 結(jié)果評判 原標(biāo)準(zhǔn)組合中唯一一項體內(nèi)試驗 采用大鼠或小鼠（ 6～ 10周） 分析骨髓中嗜多染紅細胞中的微核，嗜多染紅細胞是紅細胞成熟的一個階段，主核已排出，容易觀察微核 遺傳毒性試驗的技術(shù)要點 3 4 體內(nèi)微核試驗 微核形成 體內(nèi)微核試驗 劑量設(shè)置 ?陰性對照組 /溶劑對照組； ?受試物至少三個劑量組； ?陽性對照組； （ S2 R1建議無需每次試驗均設(shè)陽性對照） 體內(nèi)微核試驗 試驗方法 ?給藥－臨床擬用途徑； ?預(yù)試驗中測定時相點，確定正式試驗的采樣時間； ?收集骨髓細胞，離心，涂片，干燥，固定，染色 體內(nèi)微核試驗 讀片 ?計數(shù) PCE/NCE的比例－反映毒性 ?計數(shù)含微核 PCE的細胞百分率； 體內(nèi)微核試驗 S2R1推薦的試驗方法 測試系統(tǒng) 哺乳動物細胞： CHL, CHO, V79 胞質(zhì)分裂組織劑 —— 松胞素 B（ CytB） 通過阻止微絲聚合而破壞胞質(zhì)分裂所需的微絲環(huán)，從而達到阻滯胞漿分裂又不影響胞核分裂的目的。 大集落 突變體的基因損傷多僅局限于 tk 位點（即小范圍的 點突變 ）；而 小集落 突變體是 由較大范圍的 染色體改變 （染色體斷裂、缺失、重組或分離異常等）所致。在微孔中生長的抗性突變細胞集落呈 Poisson分布，根據(jù)實驗結(jié)果可計算接種效率（ plating efficiency， PE）和突變率等指標(biāo)。 因此 ， 現(xiàn) TFT已基本取代了 BUdR， 成為 TK基因突變試驗的常規(guī)選擇劑 。但張立實和 Honma等的研究表明，使用長時間 (24或 48小時 )處理可顯著提高 MLA