【正文】 mL含有 ％瓊脂、 ％ NaCl、 mM生物素和 L－ 組胺酸的融溶頂層培養(yǎng)基，鋪至基礎(chǔ)培養(yǎng)瓊脂表面（ VB培養(yǎng)基 E），在 室溫下凝固。 Ames試驗(yàn) 代謝活化系統(tǒng) ?大鼠肝 S9混合液 ?S9制備方法：取 5只雄性大鼠，處死大鼠的前 5天單次腹腔注射給予 500 mg/kg的 Aroclor 1254。處死，放血，無菌取肝組織，勻漿，經(jīng) 9000g離心 10分鐘后的上清液部分為 S9。將 S9分裝成 24mL/管，冷凍保存在 70℃～ 85℃ 。 Ames試驗(yàn) 結(jié)果觀察和判定 計數(shù)突變菌落數(shù)－致突變性 觀察背景菌斑－毒性 判斷是否具有致突變性 Ames試驗(yàn) 假設(shè)的證明 無組氨酸的 VB平皿 7個克隆來自 0對照平皿 劃線 7個克隆 來自 1000 ug/皿處理組 劃線 全部生長 : 克隆為組氨酸 回復(fù)突變克隆 無生長： 克隆 不是 組氨酸 回復(fù)突變克隆 Ames試驗(yàn) —案例 1 ?測試系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞： CHL, CHO 人外周血淋巴細(xì)胞 ?細(xì)胞核型 遺傳毒性試驗(yàn)的技術(shù)要點(diǎn) 3 2 染色體畸變試驗(yàn) (CA) 劑量設(shè)置 ?陰性對照組 /溶劑對照組； ?受試物至少三個劑量組； ?陽性對照組； 染色體畸變試驗(yàn) 方法 ?細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)； ?受試物處理； ?加入秋水仙素，使細(xì)胞停止于分裂中期； ?收獲細(xì)胞，滴片 ?空氣干燥，染色 染色體畸變試驗(yàn) ?包括代謝活化和非代謝活化條件 ?在處理后 6和 24小時收獲細(xì)胞 ?代謝活化條件下，受試物處理時間為 3小時 染色體畸變試驗(yàn) 處理?xiàng)l件 讀片分析 ?有絲分裂指數(shù)－毒性 ?染色體結(jié)構(gòu)畸變 ?染色體數(shù)目畸變 染色體畸變試驗(yàn) ?試驗(yàn)系統(tǒng) 小鼠淋巴瘤 L5178Y TK+/細(xì)胞 ?既能夠檢測點(diǎn)突變，也能夠檢測出大的染色體損傷 ?自發(fā)突變率高，需要定期清除自發(fā)突變。 3 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 遺傳毒性傳統(tǒng)試驗(yàn)方法 Thymidine Kinase (TK): 233 amino acids Coded by the autosomal tk gene tk gene: Situated at the distal end of the qarm of chromosome 11 (mouse) or chromosome 17 (human) Size of tk gene: 11 kb with 5 introns tk locus mutation: tk+ tk allele caused by T G transversion at position 489 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 基本原理 Target cell： Mouse lymphoma L5178Y tk +/ cell line ( . Mutat Res, 1977 ) L5178Y3 cell line （ tk +/+ ） EMS treatment cell line （ tk +/ ） cell line （ tk / ） Spontaneous reverse mutation (selected by THMG medium) MLA 基本原理 TK +/ cells (TFT sensitive THMG resistant) TK / cells (TFT resistant THMG sensitive) Mutagen treatment TK +/ cells (L5178Y, TK6, WTK1) treated by chemicals, and then selected by TFT (trifluorothymidine) The growing colony — TFT resistant ( TK / ) mutant MLA 基本原理 培養(yǎng)基 不含馬血清的 RPMI1640培養(yǎng)基 含 10%馬血清的 RPMI1640培養(yǎng)基 含 20%馬血清的 RPMI1640培養(yǎng)基 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 受試物處理時間 TK基因突變試驗(yàn)中，要使用短時處理 (3～ 4小時 )方式。但張立實(shí)和 Honma等的研究表明，使用長時間 (24或 48小時 )處理可顯著提高 MLA對某些染色體斷裂劑和紡錘體毒物的檢出率。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 突變選擇劑 在 MLA中最初使用 5溴脫氧尿苷 （ BUdR） 作為突變選擇劑 ， 后來改用三氟胸苷 （ TFT） 。 二者均為胸苷類似物 ， 都能被胸苷激酶磷酸化 ， 其磷酸化產(chǎn)物摻入 DNA 可導(dǎo)致 tk+/ 細(xì)胞死亡 。 但 TFT的作用比 BUdR更迅速 ， TFT在一個細(xì)胞世代即可阻滯 tk+/ 細(xì)胞 ， 因此 TFT選擇平板背景清晰；而 BUdR則需要經(jīng)歷數(shù)個細(xì)胞世代才能完全阻滯 tk+/ 細(xì)胞 ，故可產(chǎn)生分散的微小集落 （ microcolony） ， 形成特征性的背景陰影 （background haze） 。 因此 ， 現(xiàn) TFT已基本取代了 BUdR， 成為 TK基因突變試驗(yàn)的常規(guī)選擇劑 。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 基本方法 ? 軟瓊脂平皿法（ soft agar method）在美國使用較多。在平皿中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈近似正態(tài)分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計算克隆效率（ cloning efficiency， CE）和突變率（ mutation frequency， MF）等指標(biāo)。 ? 微孔平板（ microwell method） （即 96孔培養(yǎng)板）法在歐洲使用較多。在微孔中生長的抗性突變細(xì)胞集落呈 Poisson分布，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計算接種效率（ plating efficiency， PE）和突變率等指標(biāo)。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） Cells Expression (2d) Chemical treatment (3h or 24h) Plating for PE0 Plating for PE2 Plating for TFTr Incubation (12d) Colony counting and calculation Incubation (12d) 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 突變集落 ?在 TK基因突變試驗(yàn)中，經(jīng)過 TFT選擇后長出的抗性細(xì)胞集落（即 tk/突變體）可分為兩種類型，即大集落（ λ 集落）和小集落（ σ 集落）。 ?微孔平板法：大集落 ≥ 微孔直徑的 1/4 小集落＜微孔直徑的 1/4 ?軟瓊脂平皿法：大集落直徑 ≥ 小集落直徑＜ ?大集落呈彌散性生長，其密度低；小集落呈集中性生長，其密度高。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 一般認(rèn)為大、小集落突變體是由于基因損傷的范圍和程度不同所致。 大集落 突變體的基因損傷多僅局限于 tk 位點(diǎn)（即小范圍的 點(diǎn)突變 ）；而 小集落 突變體是 由較大范圍的 染色體改變 （染色體斷裂、缺失、重組或分離異常等）所致。這是 TK基因突變試驗(yàn)?zāi)軌驒z出基因突變和染色體畸變兩類終點(diǎn)，并能在一定程度上對 二者加以區(qū)分的重要機(jī)理。但關(guān)于兩類集落產(chǎn)生的確切機(jī)制及其意義，還有待進(jìn) 一步的研究。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（ MLA） 試驗(yàn)結(jié)果的判定 ? 各處理組的 MF值呈 濃度依賴性升高 ，判定為陽性； ? MF值 ≥陰性對照值 +126，