【正文】 對某些染色體斷裂劑和紡錘體毒物的檢出率。處死，放血，無菌取肝組織，勻漿，經(jīng) 9000g離心 10分鐘后的上清液部分為 S9。 ICH S2(R1) Pfuhler S. et al. 2023 藥物遺傳毒性評價的指導(dǎo)原則 1 遺傳毒性試驗方法的研究 2 藥物致癌性評價的概要 3 傳統(tǒng)和替代致癌試驗的研究 4 4 主要內(nèi)容 遺傳毒性傳統(tǒng)試驗方法 3 1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗（ Ames試驗） 人工誘變的突變株在組 /色氨酸操縱子中有一個突變，突變的菌株必須依賴外源性組 /色氨酸才能生長，而在無組 /色氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活，致突變物可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，使它在缺乏組 /色氨酸的培養(yǎng)基上也能生長。 野生型 （原養(yǎng)型） 突變型 （缺陷型） Ames試驗 ?測試系統(tǒng)：細(xì)菌 鼠傷寒沙門氏菌：組氨酸營養(yǎng)缺陷型 埃希氏大腸桿菌：色氨酸營養(yǎng)缺陷型 ?菌株特性鑒定 菌株 組 /色氨酸突變 缺失 可檢測的 突變類型 修復(fù) LPS VIT 質(zhì)粒 TA 1535 G46 urvB rfa bio 堿基置換 TA 1537 C3076 urvB rfa bio 移碼 TA97 D6610 urvB rfa bio pKM101 移碼 TA 98 D3052 urvB rfa bio pKM101 移碼 TA 100 G46 urvB rfa bio pKM101 堿基置換 TA 102 G428 urvB+ rfa bio pKM101 堿基置換 WP2uvrA tryp E uvrA pKM101 堿基置換 Ames試驗 Ames試驗 濃度設(shè)置 ?陰性對照組 /溶劑對照組； ?受試物至少五個劑量組； ?陽性對照組； Ames試驗 方法 平板摻入法： mL受試菌液； mL受試物、溶劑對照或陽性物溶液； mL磷酸鈉緩沖液 /S9混合液； mL融溶的頂層瓊脂 （ ％瓊脂、 ％ NaCl、 mM生物素 和 －組胺酸 ） 混合后，鋪于底層瓊脂上，室溫凝固。將 S9分裝成 24mL/管，冷凍保存在 70℃～ 85℃ 。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗（ MLA） 突變選擇劑 在 MLA中最初使用 5溴脫氧尿苷 （ BUdR） 作為突變選擇劑 ， 后來改用三氟胸苷 （ TFT） 。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗（ MLA） 基本方法 ? 軟瓊脂平皿法（ soft agar method）在美國使用較多。 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗（ MLA） Cells Expression (2d) Chemical treatment (3h or 24h) Plating for PE0 Plating for PE2 Plating for TFTr Incubation (12d) Colony counting and calculation Incubation (12d) 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗（ MLA） 突變集落 ?在 TK基因突變試驗中，經(jīng)過 TFT選擇后長出的抗性細(xì)胞集落（即 tk/突變體）可分為兩種類型，即大集落（ λ 集落）和小集落（ σ 集落）。這是 TK基因突變試驗?zāi)軌驒z出基因突變和染色體畸變兩類終點，并能在一定程度上對 二者加以區(qū)分的重要機(jī)理。 體外雙核微核 濃度設(shè)置 陰性對照組 /溶劑對照組； 受試物至少三個濃度組 陽性對照組； 體外雙核微核試驗 方法 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)； 受試物處理； 收獲細(xì)胞，滴片 空氣干燥，染色 (+CytB) (+CytB) 體外雙核微核試驗 讀片分析 胞漿分裂阻斷增值指數(shù)（ CBPI） －細(xì)胞毒性 雙核微核率 （ 1000～ 2023個雙核） 體外雙核微核試驗 給藥染毒 采集血樣（～ 100?l） － 80℃ 至少固定 3d 離心 (300g,10min,4℃ ) buffer洗脫 孵育標(biāo)記 FCM檢測 4℃ , 30min RT/37℃ , 30min S2R1推薦的試驗方法 FCM體內(nèi)微核自動化檢測 FCM體內(nèi)微核自動化檢測 ?甲醇（ %） ?－ 80℃ ?至少固定 3d ?AntiCD71FITC ?AntiCD61PE ?PI ?RNase ?生物標(biāo)準(zhǔn)品 —伯氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞模仿 MN ?調(diào)節(jié) PMT電壓 ?調(diào)節(jié)補(bǔ)償 血樣固定 標(biāo)記染色 質(zhì)控 FCM體內(nèi)微核自動化檢測 圖 1 利用 CD71()樣品和瘧原蟲生物標(biāo)準(zhǔn)品建立 FCM檢測小鼠外周血 MN的模板。 piga突變導(dǎo)致細(xì)胞表面 GPI錨蛋白缺陷。 組數(shù)和每組動物數(shù) 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 104周大鼠口服給藥致癌實驗 * 若賦形劑不常用，可增加一個對照組； 因為有中期剖檢和毒代用動物數(shù)量增加 Note：根據(jù) ICH指導(dǎo)原則，對于長期用藥， 6個月毒理試驗加一個兩年致癌性試 驗足夠了，無需 12個月的毒理試驗。 如果可行的話，確認(rèn)腫瘤的原發(fā)部位 將腫瘤歸類為“致命”與“非致命”： 有沒有可能是腫瘤促成的動物提前死亡或死亡 要求專業(yè)判斷 要求做 Peto試驗 計劃處死的動物不需要 記錄計劃處死前解剖的動物死亡或瀕死的原因 顯微評價 傳統(tǒng)兩年致癌性試驗 致癌性實驗是評價化合物在動物體內(nèi)潛在致癌性的特定的非臨床安全性評價，旨在增進(jìn)人類的潛在致癌風(fēng)險評價 致癌性試驗開展時間取決于藥物的類型和關(guān)注程度 通常在臨床試驗第二，三階段進(jìn)行，很少在第 IV階段（上市后）進(jìn)行 通常 104周的生物評價采用大鼠或小鼠進(jìn)行 使用轉(zhuǎn)基因動物或敏感的體外試驗來推進(jìn)致癌性試驗 一些藥物可能不需要進(jìn)行致癌性試驗 細(xì)胞毒性抗癌藥物一般不需要進(jìn)行致癌性試驗 生物技術(shù)藥物也可除外（ ICH S6） 專題負(fù)責(zé)人、毒理人員和統(tǒng)計人員作為一個團(tuán)隊，共同設(shè)計、執(zhí)行和評估 選擇種屬應(yīng)考慮藥代、毒代情況 實驗中每組必須有足夠的動物，試驗設(shè)計或執(zhí)行使偏離最小化 劑量選擇是關(guān)鍵，必須顯示暴露范圍，從推薦人用劑量到 MTD或最大可行劑量 活體階段，死亡、解剖和顯微數(shù)據(jù)必須銜接 對數(shù)據(jù)全面評價的統(tǒng)計方法必須適當(dāng) 總結(jié) 替代致癌性試驗 ICH S1B 潛在致癌性研究的指南 ? 1997年： 1個兩年性致癌試驗 +1個替代模型的體內(nèi)試驗 ? Trp 53+/ （應(yīng)用于遺傳毒性的藥物） ? rasH2（應(yīng)用于遺傳毒性和非遺傳毒性的藥物） ? （局部采用，許多陽性結(jié)果，遺傳不穩(wěn)定） ? XPA/和 XPA/x p53+/ ? 新生鼠 ? 開始啟動（ Ito 模型） p53+/ 轉(zhuǎn)基因小鼠 替代致癌性試驗 應(yīng)用替代模型的原因 ? 減少動物使用并降低費(fèi)用 ? 兩年致癌試驗的問題被廣泛認(rèn)知 — 肝細(xì)胞腫瘤；許多發(fā)現(xiàn)與人不相關(guān) ? 提供有助于風(fēng)險評估的其他信息 ? 如有時間要求，可以縮短至 9個月 ? 可以延長試驗直至 III期結(jié)果顯示成功 ? 陽性結(jié)果的幾率降低 rasH2 轉(zhuǎn)基因小鼠 替代致癌性試驗 Trp53+/和 rasH2模型的基礎(chǔ) ? Trp53+/半合子敲除小