【正文】 平，由于這樣可以看出基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性的變化。值得一提的是，如果遺傳改造是為了提高植物對細(xì)菌或者真菌病原菌的抵抗力而釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如細(xì)胞壁溶解酶或者像 T4 溶解酵素的化合物、幾丁質(zhì)酶或者抗菌肽等，那么就不能排除土壤微生物群落未知的改變，因此應(yīng)該進(jìn)行評估。 在過去的二十年中，科學(xué)知識有了長足的進(jìn)步，可以更加精確地跟蹤環(huán)境中的微生物并且可以在物種和菌株水平進(jìn)行鑒定。其中使用的一個主要方法是檢測加入構(gòu)建的和原來的細(xì)菌群以后對根圍、土壤酶 N乙酰氨基葡糖苷酶 、果膠酶、酸和堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、 芳基硫酸酯酶 和尿酶，這些酶在土壤的 C、 N、 P 和 S 的循環(huán)中起著重要的作用。 結(jié)果顯示沒有標(biāo)記基因的運動，對于原來的群落只有小的 瞬間的影響。沒有污染的空白對照土壤也用熒光原位雜交測定。因此，這是兩種土壤中最大的孤立群體。低濃度和高濃度的金屬污染的土壤 DNA 豐富度分別是 1010bp 和 109bp，分別相當(dāng)于大約 4600 個和 1500 個像大腸桿菌一樣的基因組。由此可見，耕種土壤的總遺傳多樣性大概比相對沒有受干擾的土壤低 24 倍，并且整個的遺傳多樣性提供了一個很好的由農(nóng)業(yè)管理引起的干擾指標(biāo)?？寺〉臄U(kuò)增子可以與指紋圖譜方法的進(jìn)行比較（如 ARDRA）。 標(biāo)準(zhǔn)的熒光原位雜交方法存在一些缺陷，在敏感度方面它不能檢測出低核糖體含量的細(xì)胞。 通過選擇 rRNA 的保守的、可變的和超變區(qū)序列，探針可以標(biāo)記從域到亞種的不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育基團(tuán)。 根 據(jù) Gomes 等報道，區(qū)分不同的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育群體可以使用以下引物： F984GC,F27,R1378 和 R1494（細(xì)菌）和 F243HGC（放線菌）， F203α（ α變形菌） 和 F948β（ β變形菌）。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離。通過使用計算機(jī)程序在數(shù)據(jù)庫中在 16SrDNA 序列上確定恰當(dāng)?shù)南拗菩?酶切位點， 不同的限制性酶切出的 rRNA 的TRF 片段大小差異可以預(yù)測出來，實驗獲得的 PCR 擴(kuò)增物的 TRF 峰或者從群落 DNA獲得的 16SrDNA 克隆文庫可以與預(yù)測的 TRF 峰或者系統(tǒng)發(fā)育分類進(jìn)行比較。 SSCP 方法原則上比 DGGE/TGGE 方法要容易操作，因為它不需要帶 GC 夾子的引物和梯度凝膠所需要的特殊儀器。 SSCP，像 DGGE/TGGE 一樣，可以檢測從 rDNA 可變區(qū)獲得的不同 PCR 擴(kuò)增物的序列變化。 這種技術(shù)的一個不足就是不同生物的 16SrDNA 能夠在變性凝膠上形成一條特定的條帶。在 DGGE/TGGE 方法中，相同長度但是不同核苷酸序列的 DNA 片段被分離。這種非培養(yǎng)的 rRNA 方法揭示了新的血統(tǒng)，在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)角度不同于培養(yǎng)方法和特征性的土壤探針。從F質(zhì)粒獲得的 BAC 載體可以在大腸桿菌宿主內(nèi)穩(wěn)定地保存大的插入序列。 Dr248。中等分辨率 比較分析微生物種群 的分布，監(jiān)測群落組成的變化 PCRARDRA 簡單群落，種群或者系統(tǒng)發(fā)育屬的遺傳指紋圖譜。 當(dāng)應(yīng)用于微生物群落 DNA 時， C0t1/2值 被用作遺傳多樣性的一個參數(shù)，它包含了 群落總的遺傳信息（豐富度成分）和不同遺傳型之間的差異信息（均勻度成分）。土壤微生境或者是埋于甲烷氣體環(huán)境下以此為 C源（ CH），或者是在厭氧條件 下 （ N2） 。雙苯酰亞胺 氯化銫梯度超離心分離得到的群落 DNA 片段可以結(jié)合分子生物方法來進(jìn)一步分析不同的 G+C%含量，例如 PCR 和 DGGE。解鏈曲線轉(zhuǎn)化成 %G+C 的峰，以此來提供微生物群落的峰，從而能夠指示整個的遺傳多樣性。他們認(rèn)為，從整個群落和（或）分離的或克隆得到的峰通過與預(yù)先存儲的 TRF 片段的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，可以直接鑒定峰中的某些片段 在分類學(xué)中的位置。 通過高和低的分辨率 ， 細(xì)菌人工染色體文庫可以用來在系統(tǒng)發(fā)生和功能水平上研究土壤微生物多樣性。 但是 ， 取自環(huán)境中的樣品無論是可培養(yǎng)的還是不可培養(yǎng)的微生物都可以用基于提取、純化和核苷酸特性的分子技術(shù)來鑒定。 CLPP 方法得出的數(shù)據(jù)經(jīng)常被用于表示土壤功能多樣性。Nannipieri 等討論了例如土壤呼吸、酶活力、硝化作用等傳統(tǒng)方法的優(yōu)點和不足。根據(jù) Giller 等， 如果微生物多樣性改變后，土壤微生物的有用的冗余程度將會導(dǎo)致對土壤微生物群落沒有影響。由此推知，特別是在像季節(jié)性的干旱或者溫度周期性變化等這些外部因素變化強(qiáng)烈的氣候區(qū)，多樣性顯得很重要。 然而，超過某一點，恰恰相反，資源不均一性和多樣性會減少。 圖 3 MacArthur(1995，左 )的食物網(wǎng)模型， May(1973,右 )的。 對多樣性的積極影響可以增加土壤微生物的穩(wěn)定性、彈力、抵抗力甚至生產(chǎn)力。然而，土壤生物量 被界定為一種三維立體多樣性，包括根圍和絕大部分土壤、大團(tuán)聚體和微小聚體、大孔徑和小孔徑以及不同范圍等之間的可能性差異（圖一）。整體 性的工具也適用于研究單個微生物細(xì)胞和群落相對于環(huán)境的功能多樣性。本文討論的其他方面有揭露土壤微生物對轉(zhuǎn)基因生物的影響，因為人們越來越關(guān)注轉(zhuǎn)基因生物在開放性環(huán)境中的使用，例如農(nóng)業(yè)土壤。關(guān)于這 個問題，已經(jīng)引起了一些相關(guān)的科學(xué)討 論、公眾關(guān)注和國際相關(guān)機(jī)構(gòu)的參與，也有相關(guān)的 國內(nèi) 或國際法律法規(guī)的建立 。根據(jù)現(xiàn)代進(jìn)化理論，遺傳密碼的變異性和適應(yīng)性使得單個物種逐步進(jìn)化并且能夠在變化的環(huán)境中生存。 生態(tài)系統(tǒng)多樣性 是指棲息地、生物群落和含有各種生物生存和進(jìn)化的生態(tài)系統(tǒng)的數(shù)量和豐度。 一般關(guān)于遺傳改造的細(xì)菌的 研究大部分集中在 其在環(huán)境中的留存時間、在根際的定植能力和生存能力 ，而不直接涉及微生物多樣性的問題。 . Nuti 盡管 取得了一些進(jìn)步，但是 土壤 微生物多樣性和土壤功能性之間的聯(lián)系仍然是一個很大的難題。它是時間（進(jìn)化）和空間（地理分布） 作用 的 結(jié)果 。物種由具有不同遺傳特征的個體組成 。該文討論了像低 pH 值和污染物等環(huán)境壓力對土壤微生物多樣性和土壤功能的影響，但是未涉及轉(zhuǎn)基因生物的影 響。 該文也將討論生態(tài)學(xué)理論在土壤研究中的應(yīng)用，盡管這些理論一般只適用于地上系統(tǒng)，但是由于微生態(tài)概念的發(fā)展這些顯得日益重要。這包括在 基因組學(xué)和蛋白組學(xué)水平上通過獲得活體信息成像來 研究個體細(xì)胞。從傳統(tǒng) 的生境多樣性來看 似乎合理，所以這個概念也可能用于描述土壤微生物多樣性的概念。其中有消極的作用如壓力，積極的作用如資源多樣性或生物之間的相互影響（圖二）。由于支持競爭性假設(shè)的實驗證據(jù)仍然存 有異議，所以 30 年后這場爭論依然沒有解決。 該假設(shè)認(rèn)為，隨著生境的平均質(zhì)量的提高，資源的空間變化性和多樣性也將增加，因此導(dǎo)致生產(chǎn)力和多樣性增加。這種效應(yīng)是由單個物種對波動的 反應(yīng)、反應(yīng)的非同步性程度和反應(yīng)的具體形式所決定。但是有一種共識就是 恒定的環(huán)境下極少數(shù)的物種對于生態(tài)系統(tǒng)功能是必需的，在變化的環(huán)境下大量的物種對于維持生態(tài)系統(tǒng)過程 穩(wěn)定性 很有必要。用 14C 標(biāo)記的化合物監(jiān)測 C 氧化為 CO2或者用 15N 富集的化合物監(jiān)測土壤中 15N 的分布， 具有代表性的這兩個例子可以提供土壤生物過程的數(shù)量分析。 圖 5 地表植物 對于土壤微生物群的代謝平均度的影響 一個長期爭論的問題是 ： 多樣性是否與生產(chǎn)力相關(guān)，特別是植物產(chǎn)量。一個強(qiáng)有力的證據(jù)就是當(dāng)在顯微鏡下觀察土壤細(xì)菌時 ，看到的大部分是活的 ， 但是在瓊脂平板上卻不能形成可見的菌落。例如， 細(xì)菌人工染色體載體可以用來直接從土壤微生物群落中克隆大片段的 DNA。 Osborn等曾發(fā)現(xiàn) rRNA 的基因的 TRFLP 的峰可以用來區(qū)分鞘氨醇單胞菌 屬的物種。用一個恒溫的試管在慢慢加熱的條件下 ,通過紫外分光光度計測定 260nm 處的吸光度來檢測 DNA 的解鏈。因此，這個方法可以用來大致的反應(yīng)干擾條件下微生物群落組成的變化。 圖 8 給出了一個適于耕種土壤中微生境 9 群落 DNA的 C0t 曲線的 例子。這分別相當(dāng)于 3200 和 340 個不同的大腸桿菌基因組。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構(gòu)，群落組成的時間和空間的變化 PCRSSCP 個別條帶測序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢群落成員的聯(lián)系，中等分辨率 比較分析群落結(jié)構(gòu)，群落組成的時間和空間的變化 PCRTRFLP 群落組成，優(yōu)勢群落成員的相對數(shù)量豐度。nstad等 . 1996。 大片段的土壤群落 DNA（ 100kb）不用 PCR 擴(kuò)增就可以直接克隆進(jìn) BAC 載體。 基于 rRNA 的方法已經(jīng)顯示了原核微生物中高度發(fā)散的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系， 它代表了地球上 絕大多數(shù)的遺傳多樣性。 用 DGGE 和 TGGE 的方法 PCR擴(kuò)增 rDNA 的 DNA指紋圖譜可以提供群落組成的信息。前面的引物與富含 G+C 的序列（ GC夾子，通常達(dá) 40bp 長度）相共價連接以阻止雙鏈全部解鏈。 它們在調(diào)查微生物群落空間和時間的差異時很方便，可以提供優(yōu)勢菌群的變化信息。 SSCP 已經(jīng)被用于區(qū)別純培養(yǎng)的土壤微生物和不同植物不可培養(yǎng)的根圍微生物群落的群落指紋圖譜。所以， TRFLP 結(jié)合了 PCR、 RFLP 和凝膠電泳三種技術(shù)。 RISA 是基于 16S 和 23S rRNA 基因之間核糖體基因間隔區(qū)的長度多態(tài)性，這個間隔區(qū)的長度具有菌株或者物種特異性，通常在 50bp 到 1500bp 之間。在復(fù)雜的群落中，針對群落的一部分使用引物靶標(biāo)特殊 14 基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基團(tuán)（產(chǎn)甲烷的），可以利用基于 rRNA 的指紋圖譜技術(shù)來部分的分析群落。探針的特異性取決于目標(biāo)序列的變化。 在熒光原位雜交技術(shù)中，使用落攝式熒光顯微鏡即可看到被標(biāo)記的微生物。 15 細(xì)菌、真菌和古生菌的 rRNA 基因通過使用區(qū)域特異性和廣泛的引物 已經(jīng)被獨立的 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出來。 這在適于耕種土壤和有機(jī)土里面分別相當(dāng)于大約 340 和 8000 個不同的大腸桿菌基因組大小（ 106bp）的遺傳多樣性。金屬污染的土壤多樣性減少，并且與污染的程度有關(guān)。關(guān)于孤立群， 3037%屬于低 mole%G+C 的革蘭氏陽性菌。 全部細(xì)胞熒光原位雜交使用了屬特異性的 16S 和 23SrRNA 系統(tǒng)發(fā)育探針， PCR 擴(kuò)增的土壤中的總 16S 和23SrDNA 的 300 個克隆用點墨雜交。 標(biāo)記基因（ lacZY 和 kanrxylE） 被選作標(biāo)記以減少簡單培養(yǎng)方法鑒定和檢測轉(zhuǎn)基因微生物的困難，它定位于 染色體的 1Mb 處以確保遺傳型和表型的穩(wěn)定，并且使與此兩種谷物相關(guān)的微生物種群的任何基因改變變得容易。這個構(gòu)建的和原來的種群被用來研究熒光假單胞桿菌對土壤微生物群的影響。包括歐盟至今都沒有一 個立法機(jī)構(gòu)。 傳統(tǒng)的 育種 技術(shù)和遺傳改造一樣，可能會影響根圍土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，例如根的形態(tài)學(xué)和生理學(xué) 的變化、植物分泌物，這些可能影響植物有益微生物和有害微生物的平衡。 因為這些田間試驗有足夠的重復(fù)可以分析和可以在不同的田間位置不同的植物生長階段采集樣本，所以這也是研究父本變化和不同的轉(zhuǎn)化之間的 有無 潛在不同的理想田間試驗。與許多其他的轉(zhuǎn)基因植物相比， D252。這種方法可以檢測根圍細(xì)菌同生群的變化，既包括 不易培養(yǎng)的細(xì)菌又包括不可培養(yǎng)的細(xì)菌。最適合這種研究的方法似乎是 D/TGGE，它們可以通過非培養(yǎng)的方法 來分析大量的樣品并且鑒定不同的條帶。自然轉(zhuǎn)化 提供了一個有能力的細(xì)菌通過獲得其周圍的 DNA 來產(chǎn)生遺傳多樣性的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制。不同的有生命的和無生命的因素似乎影響土壤中自由 DNA 的存留時間，并且關(guān)于最近出版了關(guān)于非無菌 土壤中的 DNA 存留的一些報告。其中的一部分在兩年后仍可以檢測到。 由于植物 DNA 可以吸附在土壤顆粒上或者被植物細(xì)胞所保護(hù)，所以這些 DNA 可以讓植物殘體附近附著定植的有能力的細(xì)菌所捕獲。 有報道稱，青枯病的引誘劑 —— 青枯病菌可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)化能力并且可以在植物中交換遺傳信息。 經(jīng)過研究證實，在缺少重要的同源 DNA 的情況下往細(xì)菌基因組中整合轉(zhuǎn)基因的可能性很低。 目前，關(guān)于野外環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)化過程的重要性我們所了解的依然很少。 具有抗性的細(xì)菌不僅僅在醫(yī)院環(huán)境里有，在野外環(huán)境樣品和食物中也很容易分離到。 11 討論 關(guān)鍵的問題是 生物多樣性的減少會不會對地球上的生命有任何的影響。 鑒定所有的土壤中的微生物物種不僅是個難題而且可能對于我們加深了解微生物多樣和土壤功能之間的關(guān)系沒什么幫助。但是，轉(zhuǎn)基因抗叢根病的甜菜的組成部分可以在土壤中留存