【正文】 由于一個基因一種蛋白的說法太過單純，因為在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都可以發(fā)生改變，并且調(diào)控可以在蛋白質(zhì)翻譯水平發(fā)生，所以， DNA 和 mRNA 的檢測應(yīng)該結(jié)合蛋白組學(xué)的方法的應(yīng)用以測定土壤中蛋白的表達(dá)。 作為人為影響土壤微生物多樣性的一個例子，我們集中于研究轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因微生物對土壤微生 物群的影響。事實上，生態(tài)理論廣泛的適用于地上系統(tǒng)。但是，水平基因轉(zhuǎn)移沒有固定 的結(jié)果，除非有外界的選擇壓力。例如像可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等這 樣的遺傳移動元件在細(xì)菌種群間的抗性基因擴散方面具有很重要的作用，并且導(dǎo)致了大量的具有抗性的病原菌的出現(xiàn)。 自然轉(zhuǎn)化的主要限制性因素是有能力的細(xì)菌的出現(xiàn)和其能力的發(fā)展。但是，如何評定此發(fā)現(xiàn)的意義？首先，觀察這種基因轉(zhuǎn)移的頻率是很重要的。但是最近人們證實，在優(yōu)化的實驗室條件下，基于同源重組， Aciobacter sp. BD413 pFG4ΔnptII可以捕獲和整合轉(zhuǎn)基因植物的 DNA。長時間的留存會似乎會加強細(xì)菌轉(zhuǎn)化的可能性，即使是植物釋放的 DNA 的一小部分。在高溫高濕條件下轉(zhuǎn)基因 DNA 減少得更快。 但是，關(guān)于像在土壤、堆肥、糞便和污物等不同的環(huán)境條件下，細(xì)菌或植物的 DNA 的自然轉(zhuǎn)化 有多重要，至今仍然不清楚。（由于環(huán)境影響已經(jīng)排除，所以結(jié)果更能說明轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物群落的影響。 Heuer 等在研究中使用的方法似乎特別適合檢測根圍微生物群落變化 ，由于它很容易檢測出根圍微生物群落的季節(jié)性變化。細(xì)菌群落用了三種不同的方法分析，以達(dá)到互補的目的。 轉(zhuǎn)基因耐草甘膦的油籽變種 Quest 看起來很獨特，并且其根圍微生物群落與其他的三種耐草銨磷和四種常規(guī)的油籽的根圍微生物群落不同。研究根圍和土壤細(xì)菌群落在時間上和空間上的變化，必需使用 分子生物技術(shù)分析大量的樣本。但是，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物對于土壤微生物群落的潛在影響卻鮮有研究報道。 當(dāng)將 惡臭假單孢菌 WCS358r 和獨立的產(chǎn) 吩嗪 1羧酸 （抗菌復(fù)合物） 轉(zhuǎn)基因微生物 WCS358r::phr處理種子后，通過 重復(fù) ARDRA 產(chǎn)峰集中分析， 小麥根部的真菌種群發(fā)生變化。因此，雖然轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在田間具有競爭力，但是野生型的卻具有更強的競爭力。其中大多數(shù)的接種菌都由根瘤菌組成，其他的應(yīng)用有接種水稻 AzollaAnabaena、 谷類作物 或者牧草 接種 azospirilli（主要有高粱、玉米、小麥）、 大量樹木接種菌 根真菌（例如柑橘、櫟樹、柳樹、椴樹、榛樹、楊樹、玉米、洋蔥等） 和桿菌、假單胞菌和木霉的物種用作生防制劑（例如植物保護劑抗病原菌，主要是真菌）。微生境調(diào)查顯示一些種群類型在壓力條件下會變?yōu)閮?yōu)勢群體。對大約 300 個克隆和 300 個 細(xì)菌群體一起進行分析顯示，非培養(yǎng)方法（ FISH 和克隆分析）得出相似的結(jié)果，然而培養(yǎng)方法（孤立分析）卻顯示群落組成有很大的不同。這將導(dǎo)致很低的平均度，因此與牧地土壤相比耕種土壤的遺傳多樣性也很低。 7 使用分子學(xué)方法在不同水平上評估農(nóng)業(yè)管理和污染對于土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響 不同的農(nóng)業(yè)管理和重金屬污染的土壤都使用群落結(jié)構(gòu)的多樣性和變化作為干擾和污染的 生態(tài)指標(biāo) 。 FISH 已經(jīng)被用于鑒定不可培養(yǎng)的 微生物，研究微生物群落的分布和數(shù)量。 Amann和 Wagner 等提供了關(guān)于這方面的步驟和方法學(xué)的出色綜述。由 Vainio 和 Hantula 發(fā)現(xiàn)的真菌引物已經(jīng)被成功的用于研究熱帶玉米的田間和根圍土壤的真菌群落多樣性。 RISA的 自動版本，叫做 ARISA，它使用 熒光標(biāo)記前端引物來 PCR 擴增內(nèi)部間隔區(qū)。 ARDRA 是在細(xì)菌鑒定和物種水平分類方面強有力的一個工具，它已經(jīng)被用來分類大批的分離株 和克隆物。這些 PCR 擴增物通過使用引物連接到 rRNA 基因可變區(qū)附近的一致性序列而從微生物群落 DNA 獲得。這種優(yōu)化的凝膠限制雙鏈但是允許 DNA 鏈的分子內(nèi)部折疊。分離較好的 DGGE 條帶可以從凝膠上切下來進行測序。具有不同序列的 DNA 分子在熔解時將會產(chǎn)生差異。 6 土壤微生物群落的遺傳指紋圖譜和通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序 12 列來鑒定群落成員 基于 PCR 擴增的遺傳指紋圖譜方法在分離擴增物方法有很多不同的方法。這種方法的一 個優(yōu)點是不要通過 PCR 擴增，因而避免了許多其他指紋識別和測序技術(shù)中這一步驟的缺陷。因此，必須使用一種間接地 DNA 提取方法將土壤中的細(xì)菌分離開，即在細(xì)胞溶解之前進行分級離心。高分辨率 群落成員的系統(tǒng)發(fā)育多樣性 功能基因 PCR克隆并測序 功能多樣性。vre229。為了估計土壤群落 DNA 的大小，使群落 DNA 的 C0t1/2除以 B 基因組 DNA 的 C0t1/2， 然后再乘以 B 基因組 的大小。當(dāng)在低于其解鏈點溫度大概 25℃ 時單鏈 DNA 再退火，變性的比率就指示這個遺傳復(fù)雜性。 雙苯酰亞胺優(yōu)先與 AT 堿基對結(jié)合，這會使 DNA 的浮力密度降低。這些方法適合于在種和亞種的水平上區(qū)別和鑒定微生物菌株。 其他的中等分辨率的 方法是基于保守基因的序列差異，例如編碼的核糖體 RNA、所謂的 rDNA。這一部分綜述了現(xiàn)在研究土壤微生物群落的一些分子學(xué)方法的潛力和缺陷。 圖 6 到了某個頂 點，功能多樣性（ H’）隨著土壤中微生物量和 /或有機 C 的增加而 單調(diào)遞增。 一個微生物群落對它的利用方式可以潛在的提供這個群落的功能信息，也可以獲得多樣性參數(shù)，例如 H’或者分解代謝的多功能性。 這種功能只屬于單個物種（熒光假單胞桿菌）并且取決于單一的功能 —— 產(chǎn)生 2， 4DAPG。在另一方面，在持久的壓力時沒有發(fā)現(xiàn)任何的恢復(fù)；但是對于持久的壓力微生物多樣性高的土壤比低的抵抗力要好。 比如說， Hall 等發(fā)現(xiàn) 資源不均一性和植物多樣性之間存在一種駝背 形的關(guān)系。根據(jù)的 May 的觀點，干擾應(yīng)該用絕對值，這樣的話這兩個群落對于干擾受到的影響都是相同的。 其 前提是 ， 在一個具有大量能量途徑的生態(tài)系統(tǒng)中單一物種的數(shù)量變化對其它物種的影響要比 在一個能量途徑少的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生相同變化時的影響要小?，F(xiàn)在仍然不知道這些微生境多樣性是如何并入土壤整體的多樣性的。 這樣 ， H’把 多樣性的豐富度和平等度成分都考慮在內(nèi)。盡管土壤微生物通過營養(yǎng)循環(huán)、分解作用和能量循環(huán)在生態(tài)系統(tǒng)功能扮演著很重要的角色，土壤體系忽略了當(dāng)代生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展。一篇有關(guān) 菌根對土壤健康和肥力影響的綜述已經(jīng)作為學(xué)術(shù)論文發(fā)表。 大量的微生物棲居于土壤中并且具有強大的代謝能力，這使得土壤成為一個十分神秘的生物學(xué)系統(tǒng)。 相同物種的個體 之間無論相似或者不相似，但是對于每個物種而言，所有的個體都必須具有該物種的獨特特征。 在過濾器轉(zhuǎn)化、無菌土壤中和植物中，通過在實驗室條件下重建去除抗性基因 ， 發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 水平轉(zhuǎn)移給了細(xì)菌。為慶祝意大利土壤科學(xué)協(xié)會成立五十周年 而 在 2020 年愛 瑞斯舉行的土壤緊急會議上討論了這些議題。 1 精讀報告 原文 ： J. M. Lynch. A. Benedetti. H. Insam. M. P. Nuti .K. Smalla . V. Torsvik . P. Nannipieri. Microbial diversity in soil: ecological theories, the contribution of molecular techniques and the impact of transgenic plants and transgenic microorganisms. Biol Fertil Soils (2020) 40: 363– 385 土壤微生物多樣性：生態(tài)學(xué)理論，分子技術(shù)的應(yīng)用 和轉(zhuǎn)基因植物、 轉(zhuǎn)基因微生物的影響 因 研究地上生態(tài)系統(tǒng)而建立的生態(tài)學(xué)理論卻忽略了地面以下的系統(tǒng)，盡管后者對于全球性的營養(yǎng)循環(huán)和地球上現(xiàn)存 的 生命很重要。然而，人們認(rèn)為在田間條件下這種轉(zhuǎn)移的頻率很低。 但是 ，這個標(biāo)準(zhǔn)的定義并不適用于無性繁殖的生物（ 例如細(xì)菌和病毒 ） 。因此， 土壤中 微生物特性往往比物理或者化學(xué)性質(zhì)對人工管理和環(huán)境條件 的變化更 敏感。這些投稿都有一個共識，那就是 ， 當(dāng)討論土壤危機 時 ，土壤 微生物多樣性 是其中的一個關(guān)鍵問題，因為土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性對土壤肥力有 影響。在此 ， 我 們討論土壤微生物研究如何促進生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展，反過來這些理論又將 如何促進我們更好的了解地下系統(tǒng)。 就群落水平生理學(xué)成像而言，可操作單元物種被可操作單元能力替代，以降低某一化合物。 圖 1 根據(jù) Whittaker 的觀點，生態(tài)系統(tǒng)多樣性必須在不同的水平進行觀察：一個棲息群落的 物種多樣性（ α多樣性）；隨棲息地梯度變化物種變化的速率和程度（ β多樣性）；一系列棲息地的物種豐度（ γ多樣性）。MacArthur 使用 了一個簡單的食物網(wǎng)模型來說明多樣性對穩(wěn)定性的影響，并且突然改變一個群落成員的數(shù)量作為干擾。 自從 MacArthur 的食物網(wǎng)模型出現(xiàn)后，人們提出了許多的生態(tài)學(xué)理論或者模型來解釋多樣性 穩(wěn)定 性或者多樣性 生產(chǎn)力之間的關(guān)系。但是，這種駝背形的關(guān)系僅僅適用于局部的和區(qū)域性的規(guī)模，當(dāng)在全球規(guī)模水平時 ， 能源 豐富度關(guān)系隨著能源單調(diào)遞增。 生態(tài)系統(tǒng)有兩大特性：結(jié)構(gòu)和功能。 6 3 土壤功能性 許多方法 可以用來 檢測土壤中的微生物過程或者酶反應(yīng)速率。但是， 這種方法有許多的缺點，它是培養(yǎng)基依賴性的，并且隨著培養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)的組成會發(fā)生變化。數(shù)據(jù)來自 Yan 等（ 2020，圓圈 ）和 Sharma 等（ 1997，黑點 ） 7 從這些數(shù)據(jù)可以看出，在某一特定的臨界值以前（例如 %有機 C），功能多樣性隨土壤微生物生物量單調(diào)遞增。為了說明分子方法的有效性和簡便性，文章中給出了它們在研究本地有關(guān)受污染和干擾的土壤微生物群落的 一些 具體應(yīng)用的例子 （圖 7） 。這些指紋識別方法相同的地方是都使用了 PCR 來特異擴增目標(biāo)核苷酸。 高分辨率的指紋識別方法也已經(jīng)被用于監(jiān)測微生物群落的特殊種群和評估細(xì)菌群體和克隆基因的多樣性。因此，根據(jù)堿基組成通過雙苯酰亞胺密度梯度離心可以將群落 DNA 分離開來。隨著DNA 復(fù)雜性的提高或者溶液中不同 DNA 型 的數(shù)量，變性比率 會下降。 重連結(jié)果顯示干擾減少了微生物多樣性（圖 8，表 2）。s 等 ， 1998） 10 表 1 土壤微生物多樣性研究的分子學(xué)方法 方法 信息類型和 分辨率 在土壤微生物分析中應(yīng)用 DNA 重新組合速率 總遺傳多樣性，理論性的物種數(shù)量，群落基因組 大小。高分辨率 比較 分析群落功能性的潛能 RNA 點墨雜交 群落成員的代謝活力的系統(tǒng)發(fā)育鑒定。 另外， 為了更加精確地估計高純度的 DNA，必須使用統(tǒng)一的片段長度。每一個 BAC 克隆代表一個元基因組片段 ，它可能包含具有它們自己啟動子的基因和操縱子，從而能夠使它們在大腸桿菌宿主中表達(dá)。像末 端限制性片段長度多態(tài)性 ， 這樣的新方法使用熒光標(biāo)記 PCR 擴增物，然后 通過 在自動測序系統(tǒng)中使用 激光檢測熒光 DNA 片段來分離 PCR 產(chǎn)物。隨著 DNA 分子在變性凝膠中遷移，它們開始在特定的熔解區(qū)熔解，因此它們開始變成部 分單鏈。把 DGGE 條帶的序列與數(shù)據(jù)庫中的序列比較，可以獲得原來微生物之間的系統(tǒng)發(fā)育聯(lián)系。這種 13 方法是基于單鏈 DNA 的不同分子內(nèi)折疊，其本身取決于 DNA 序列的變化。兩個引物通常都是使用熒光亞磷酰胺染料標(biāo)記 5’末端。在 PCR 過程中通過加入熒光標(biāo)記的 dUTP 獲得的熒光 PCR 擴增物可以直接進行自動的 ARDRA。然后片段進行毛細(xì)管電泳，根據(jù)大小自動分離，它們的大小可以與 DNA 數(shù)據(jù)庫中的進行比較。 另外一個鑒定群落成員的方法就是應(yīng)用特別的富 集培養(yǎng)基以加快 感興趣的微生物的生長。在probeBase 網(wǎng) 站 可 以 找 到 合 適 的 熒 光 原 位 雜 交 的 探 針（ 雜交方法可以幫助分辨群落中特殊部分（如有機群體）的物種組成。一系列不同系統(tǒng)發(fā)育探針雜交后在顯微鏡下計數(shù)，可以確定體統(tǒng)發(fā)育群體的數(shù)量和分類學(xué)上的個體的相對分布。 有上述相關(guān)技術(shù)得出的適于耕種（如谷物、蔬菜和馬鈴薯）的土壤微生物多樣性可以與有機土