【正文】 能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。然后，酶切樣品數(shù)據(jù)與使用數(shù)據(jù)庫序列獲得的已知細(xì)菌的 rDNA 限制性分析進(jìn)行比較。這種方法成功地被用來分類菌株和指紋鑒定簡(jiǎn)單的群落和混合的種群。 當(dāng)大量的 PCR 擴(kuò)增物相似性太高以致于不容易分辨時(shí)，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時(shí)就有局限。評(píng)估真菌多樣性一直是一個(gè)問題，因?yàn)槭褂玫囊锟梢酝瑫r(shí)擴(kuò)增其他真核生物的 DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。 雜交技術(shù) 該方法是 設(shè)計(jì)出與 16S rRNA 或者 23S rRNA 序列相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針 ，然后 用來和 rRNA 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料 標(biāo)記然后用來做環(huán)境樣品的單細(xì)胞的原位檢測(cè) （整個(gè)細(xì)胞雜交）。點(diǎn)墨雜交和熒光原位雜交已經(jīng)被聯(lián)合用于區(qū)分 不同程度的金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)。為了克服這個(gè)缺陷，人們采用了一種 酪胺信號(hào)放大技術(shù) 用于 FISH，該技術(shù)可以分析緩慢生長(zhǎng)的微生物。從環(huán)境中獲得的 DNA通過克隆載體由 PCR擴(kuò)增 rRNA基因得到克隆文庫。對(duì) 這些克隆的 rRNA 基因進(jìn)行測(cè)序 ， 然后與數(shù)據(jù)庫中的進(jìn)行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。 重新組合的技術(shù)顯示，根據(jù) C0t1/2值計(jì)算，微生物群落 DNA 的復(fù)雜性 在適于耕種的土壤中大概是 109bp，有機(jī)土壤中大概是1010bp。 由于含有一定數(shù)量的優(yōu)勢(shì)菌群和并且許多只是低豐度，耕種土壤的菌群可能要比牧地土壤的 分布更加不均勻。這相當(dāng)于大約 9800 個(gè)具有大腸桿菌基因組大小的不同細(xì)菌基因組。 這些探針適用于總細(xì)菌群落（ FISH），細(xì)菌單體和基于 PCR的 16S rRNA克隆文庫（空位印跡雜交）。 在重度金 16 屬污染土壤中， α變形菌的克隆在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì) （圖 9） 。 這些調(diào)查顯示，在相對(duì)干擾和污染較少的土壤中的總微生物多樣性很高，然而經(jīng)過干擾和污染的土壤中的總微生物多樣性卻劇烈的減少。 圖 9 低濃度和高濃度金屬污染的污泥土壤群落結(jié)構(gòu)變化。對(duì)于縮寫，見圖 7 8 轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)微生物群落的影響 微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用超過每年 3 億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于 1896 年（知名的根瘤菌，用來接種豆科植物）或者 19 世紀(jì) 30 年代（例如蘇 云金芽孢桿菌，用來生物防治無脊椎害蟲）。 熒光假單胞桿菌 SBW25， 分離自甜菜葉面，很容易定植于甜菜的根圍、葉面和小麥的根圍。但是卡那霉素抗性不影響生物適應(yīng)性，其他的兩種標(biāo)記則減少了生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力。為了作比較，把菌株 F113G22 進(jìn)行改造以產(chǎn)生Tn5::lacZY 不產(chǎn)生 DAPG 的衍生的 F133，此菌株沒有阻止植物病原菌真菌生長(zhǎng)的能力。 然而，關(guān)于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒有直接涉及微生物多樣性的問題，大多數(shù)集中于其他風(fēng)險(xiǎn) 評(píng)估方面的，例如它們?cè)诃h(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。 為了保護(hù)農(nóng)民和更加容易的控制或者國際機(jī)構(gòu)或相關(guān)當(dāng)局監(jiān)測(cè)，有一個(gè)確定一致的國際性的立法將會(huì)很有益的。 9 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響 過去的十年中人們使用了大量的轉(zhuǎn)基因植物，并且許多轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商品化。 第一種推測(cè)可能影響植物健康或者土壤功能，第二種推測(cè) 帶來的影響比較間接 ——標(biāo)記基因的水平轉(zhuǎn)移，主要 是看這種水平轉(zhuǎn)移對(duì)于這些基因擴(kuò)散到其他細(xì)菌群落的影響程度。如前所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。 為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的影響 ，田間試驗(yàn)是在隨機(jī)選擇的大田種植轉(zhuǎn)基因植物，并且在不同的點(diǎn)設(shè)置未遺傳改造的父本作為對(duì)照。在 Dunfield 和 Germida 的研究中，他們?cè)诩幽么笏膫€(gè)不同的地區(qū)分別種植了四種耐除草劑的和四種常規(guī)的 油籽，然后用 FAME 和 Biolog CLPP 來分析其兩季的根圍土壤群落特性。 Heuer 等研究了田間條件下馬鈴薯根圍細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性，并且與轉(zhuǎn)基因的表達(dá) T4熔解酵素的馬鈴薯植株做了比較。產(chǎn) T4 熔解酵素兩排，一排是沒有 T4 熔解酵素基因的和另一排 父本，在兩個(gè)相距很遠(yuǎn)的田間位置和不同的土壤類型的情況下，連續(xù)觀察了 3 年多。第三種方法是基于擴(kuò)增總根圍 DNA 的 16S rRNA 基因片段然后進(jìn)行 DGGE 分析或者克隆和測(cè)序。因此，轉(zhuǎn)基因?qū)τ诩?xì)菌群落的影響風(fēng)險(xiǎn)似乎比原來預(yù) 見的要低。但是，鑒定許多的分離菌需要對(duì)馬鈴薯不同行之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性的分析。 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關(guān)。細(xì)菌獲得的單鏈 DNA或者通過 同源重組被整合進(jìn)細(xì)菌的基因組，或者形成一個(gè)自 動(dòng)復(fù)制元件。 自然轉(zhuǎn)化 的前提是，可用的自由 DNA；競(jìng)爭(zhēng)性的生長(zhǎng)；獲取并穩(wěn)定的整合捕獲的 DNA。有人假設(shè)微生物或者 腐敗的植物組織釋放的自由 DNA 可以作為養(yǎng)料或者自生性細(xì)菌的遺傳信息儲(chǔ)藏庫。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 有長(zhǎng)時(shí)間的留存。為檢測(cè) DNA 而不依賴于培養(yǎng)方法，他們直接從土壤中提取總?cè)郝?DNA，然后選用三個(gè)針對(duì)轉(zhuǎn)基因 DNA 的不同的特殊引物來進(jìn)行擴(kuò)增。但是，實(shí)測(cè)到轉(zhuǎn)基因植物 DNA 卻可以躲過這些降解過程。與前面的研究相比， De Vries 等運(yùn)用一種新的特殊的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)田間土壤中的轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 最長(zhǎng)可以留存達(dá)四年。許多人 之所以 沒有檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn) 移，大概是因?yàn)榧?xì)菌中缺 21 少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細(xì)菌。這兩項(xiàng)研究都得出了相同的結(jié)果，即 Aciobacter 被轉(zhuǎn)化了并且內(nèi)部被切除的 nptII 基因作為同源序列和偵測(cè)系統(tǒng)（導(dǎo)致具有卡那霉素抗性的 nptII 基因整合）。一個(gè)關(guān)于 從轉(zhuǎn)基因植物到細(xì)菌之間發(fā)生 抗性基因的水平轉(zhuǎn)移的 新發(fā)現(xiàn)是通過用細(xì)菌的同源重組從轉(zhuǎn)基因植物中捕獲 DNA。據(jù)作者估計(jì)，是因?yàn)榉菬o菌土壤中的轉(zhuǎn)化株的數(shù)量在 1010到 1011之間，這個(gè)數(shù)值低于可以檢測(cè)到的范圍。 現(xiàn)在關(guān)于自然轉(zhuǎn)化過程的不同步驟已經(jīng)研究得很透徹了，從細(xì)胞 DNA 的釋放到它的留存到它被有能 力的細(xì)菌整合的可用性。 用來刺激 Aciobacter 種群轉(zhuǎn)化能力的營養(yǎng)溶液包含無機(jī)鹽和簡(jiǎn)單的復(fù)合物，這相當(dāng)于根圍分泌物。 由于人類大規(guī)模的使用抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌抗性的出現(xiàn)并且快速的發(fā)展。從污泥、糞便、河水到土壤中的細(xì)菌，關(guān)于使用最廣泛的標(biāo)記基因 nptII 基因的擴(kuò)散的研究證實(shí)， 在高比例的卡那霉素抗性的腸道細(xì)菌內(nèi)，抗性是由 nptII 基因編碼的。細(xì)菌本身的遺傳可 塑性是抗生素抗性出現(xiàn)的一個(gè)很大的原因。所以，公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭(zhēng)論并不能轉(zhuǎn)移人們對(duì)于引起細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學(xué)上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過量使用抗生素。 May等沒有把這種理論應(yīng)用于微生物群落，但是這不能說明它不適用。 當(dāng)然，這不適用于特殊的功能。測(cè)定限制整個(gè)土壤代謝速率的反應(yīng)速率可以減少實(shí)驗(yàn)的工作量，并且不會(huì)影響評(píng)估土壤代謝活力。 轉(zhuǎn)基因的 DNA 在植物衰老過程中會(huì)被植物核酸酶降解，或者在微生物降解土壤中殘留的植物時(shí)被降解。必須強(qiáng)調(diào)的是，公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭(zhēng) 論并不能轉(zhuǎn)移人們對(duì)于引起細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學(xué)上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過量使用抗生素。 。這種結(jié)合的方法可以更好的理解微生物多樣性和土壤功能之間的聯(lián)系。關(guān)于抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到細(xì)菌的觀察有相矛盾的結(jié)果。 一般情況下轉(zhuǎn)基因植物并不會(huì)影響細(xì)菌群的組成，并且即使當(dāng)觀察到有影響時(shí)，它們也與自然變動(dòng)無關(guān)。 或許檢測(cè)主要物種 組成的變化 更有價(jià)值，例如 硝化細(xì)菌， 只負(fù)責(zé)土壤生化過程的一部分，像自生固氮菌。 盡管使用分子生物方法可以 較好的鑒定土壤中微生物多樣性，但是關(guān)于微生物多樣性和土壤功能性之間的關(guān)系仍然不是很清楚。 May等使用數(shù)學(xué)模型證明，隨著相互影響的物種數(shù)量的增加，整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性會(huì)降低，除非遇到特殊的條件。 事實(shí)上：（ 1）通常位于遺傳移動(dòng)元件上抗性基因在細(xì)菌種群間廣泛的存在；（ 2）轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn)移被認(rèn)為概率極低 ， 并且在田間條件下檢測(cè)不到，因此說明，似乎使用具有抗性基因的植物并不會(huì)嚴(yán)重的影響抗性基因在細(xì)菌之間的擴(kuò)散。 在不同的環(huán)境之間存在大量的抗性基因和抗性細(xì)菌的移動(dòng)。因 22 為細(xì)菌可以在不同的環(huán)境和不同的地理區(qū)域之間傳播，人們需要獲得 細(xì)菌抗性的全球性流行的 數(shù)據(jù)，選擇和擴(kuò)散比以前有了更加廣泛的途徑。與此相比，報(bào)道較多的是不同環(huán)境條件下結(jié)合或 者運(yùn)用 水平基因轉(zhuǎn)移 。在關(guān)于轉(zhuǎn)化的絕大多數(shù)研究中，有能力的細(xì)菌已經(jīng)被加入到被研究的土壤中去了。在同源 DNA 存在的情況下，通過自然轉(zhuǎn)化來進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的研究顯示，當(dāng)攻擊性的同源出現(xiàn)時(shí) ，非同源遺傳材料的附加整合才會(huì)發(fā)生。 與染色體或者質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化相比，當(dāng)起始就過濾轉(zhuǎn)化 Aciobacter 的實(shí)驗(yàn)更深一步并且在無菌和非無菌土壤中進(jìn)行時(shí)，與植物 DNA 或植物勻漿之間的轉(zhuǎn)化頻率會(huì)劇烈的下降。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)感染青枯病菌的番茄被灌輸質(zhì)粒DNA 或者被攜帶不同遺傳標(biāo)記的青枯病菌共同 感染時(shí)會(huì)發(fā)生基因交換。還觀察到，不僅轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 而且轉(zhuǎn)基因植物的勻漿都修復(fù)了 317bp 的刪除，這將導(dǎo)致具有抗卡那霉素特性的 Aciobacter 的出現(xiàn)。直到現(xiàn)在，人們都沒有弄清楚細(xì)菌是否可以被植物 DNA 所轉(zhuǎn)化。 在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬 鈴薯的根圍經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)表達(dá) T4 熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。 在土壤微生境下運(yùn)用自由的轉(zhuǎn)基因 DNA 進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)，也說明其可以長(zhǎng)久的留存。 這兩種因素對(duì)土壤微生物活性都具有重要的影響。微生物活力被 認(rèn)為是影響土壤中自由 DNA 留存的重要生物因素，因?yàn)槲⑸锘盍κ艽碳そ?jīng)常引起 DNA 酶活力隨著增加。目前，眾多 課題組 對(duì)于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化 主要有兩方面： （ 1）自由 DNA 可以持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間，例如在土 壤中；這些 DNA 依然可用于自然變換么？ （ 2） 在環(huán)境條件下不同的細(xì)菌物種有多少能達(dá)到可以自然變換的狀態(tài)？ 實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物 DNA 轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的另外一條可能途徑。實(shí)驗(yàn)證明，大于 40 個(gè)來自不同環(huán)境的細(xì)菌物種是可以發(fā)生自然轉(zhuǎn)化 的。） 10 土壤中 DNA 的留存和轉(zhuǎn)基因植物 DNA 與細(xì)菌之間的橫向轉(zhuǎn)移 自然轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因植物基因與細(xì)菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的最可能機(jī)制。 在其他的溫室條件下的研究中 報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物和過程的瞬時(shí)的影響。盡管只有細(xì)菌群落中的一小部分與 Biolog類型有關(guān)，但是細(xì)菌群落的分解代謝潛能的差異可以定性定量的檢測(cè)出來。在此項(xiàng)研究中， 所有的方法都顯示是與植物生長(zhǎng)階段、田間位置或者季節(jié)相關(guān)的環(huán)境因素影響根圍群落，而不是轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的 T4 熔解酵素。在第一種方法中，根圍細(xì)菌種類的相對(duì)豐度的檢測(cè)是基于培養(yǎng)方法，然后用脂肪酸方法分析每個(gè)孤立群的特性。ring和 Mahn將遺傳改造目標(biāo)改為細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)與植物相關(guān)的細(xì)菌確實(shí)受到了影響， 至于易受轉(zhuǎn)基因馬鈴薯影響的 胡蘿卜軟腐歐文氏菌 明顯的減少了。 其他變種 19 的差異似乎主要是由土壤類型的影響。 通常人們檢測(cè)不同的轉(zhuǎn)化水平，由于這樣可以看出基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性的變化。 最近，人們報(bào)道了很多研究，他們使用了分子指紋圖譜技術(shù)來分析植物生 長(zhǎng)過程中根圍的動(dòng)力學(xué)和植物物種對(duì)根圍相關(guān)的細(xì)菌群落 豐富度的影響，觀察到在植物生長(zhǎng)過程中根圍微生物群落的相關(guān)豐 度發(fā)生巨大的變化。值得一提的是，如果遺傳改造是為了提高植物對(duì)細(xì)菌或者真菌病原菌的抵抗力而釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如細(xì)胞壁溶解酶或者像 T4 溶解酵素的化合物、幾丁質(zhì)酶或者抗菌肽等，那么就不能排除土壤微生物群落未知的改變，因此應(yīng)該進(jìn)行評(píng)估。 是不是人們覺得轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物種群的影響可以忽略，或者說至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性 18 問題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對(duì)非靶標(biāo)生物的影 響或者新的病毒的出現(xiàn)。 在過去的二十年中，科學(xué)知識(shí)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，可以更加精確地跟蹤環(huán)境中的微生物并且可以在物種和菌株水平進(jìn)行鑒定。 當(dāng)引入的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較高時(shí)，主要的影響發(fā)生在田間試驗(yàn)的初期；轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)真菌種群的組成比 WCS358r 的影響時(shí)間要持久。其中使用的一個(gè)主要方法是檢測(cè)加入構(gòu)建的和原來的細(xì)菌群以后對(duì)根圍、土壤酶 N乙酰氨基葡糖苷酶 、果膠酶、酸和堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、 芳基硫酸酯酶 和尿酶，這些酶在土壤的 C、 N、 P 和 S 的循環(huán)中起著重要的作用。