【正文】 點(diǎn)，干擾應(yīng)該用絕對(duì)值，這樣的話這兩個(gè)群落對(duì)于干擾受到的影響都是相同的。我們將討論其中的資源不均一性假設(shè)和保險(xiǎn)假設(shè)。 該假設(shè)認(rèn)為，隨著生境的平均質(zhì)量的提高，資源的空間變化性和多樣性也將增加，因此導(dǎo)致生產(chǎn)力和多樣性增加。這是因?yàn)樵谶@種條件下具有優(yōu)勢(shì)的物種在各處有利的小生境中都會(huì)受到偏愛(ài)。 比如說(shuō)， Hall 等發(fā)現(xiàn) 資源不均一性和植物多樣性之間存在一種駝背 形的關(guān)系。微生物多樣性和能源之間的關(guān)系尚不清楚，但是， 從 許多植物的特定微生物群 看來(lái)，由于微生物的資源不均一性增加所導(dǎo)致的植物多樣性的增加，微生物多樣性也會(huì)隨著增加。這種效應(yīng)是由單個(gè)物種對(duì)波動(dòng)的 反應(yīng)、反應(yīng)的非同步性程度和反應(yīng)的具體形式所決定。那些在機(jī)能上冗余的物種隨著時(shí)間的變化 也不再有很多。在另一方面，在持久的壓力時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何的恢復(fù)；但是對(duì)于持久的壓力微生物多樣性高的土壤比低的抵抗力要好。植物和動(dòng)物水平的結(jié)構(gòu)比土壤微生物水平的結(jié)構(gòu)要明顯。但是有一種共識(shí)就是 恒定的環(huán)境下極少數(shù)的物種對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)功能是必需的，在變化的環(huán)境下大量的物種對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程 穩(wěn)定性 很有必要。如果大量的物種負(fù)責(zé)簡(jiǎn)單的功能，任何物種的消失對(duì)于土壤過(guò)程都不會(huì)有任何的影響，因?yàn)槠渌挠袡C(jī)體會(huì)填充這個(gè)功能空隙。 這種功能只屬于單個(gè)物種（熒光假單胞桿菌）并且取決于單一的功能 —— 產(chǎn)生 2， 4DAPG。絕大多數(shù)方法得出的是可能 的活力 ， 而不是真實(shí)的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)是在充足的底物濃度、最優(yōu)的 pH 值、溫度值和通常在土壤泥漿里 的條件下進(jìn)行 。用 14C 標(biāo)記的化合物監(jiān)測(cè) C 氧化為 CO2或者用 15N 富集的化合物監(jiān)測(cè)土壤中 15N 的分布， 具有代表性的這兩個(gè)例子可以提供土壤生物過(guò)程的數(shù)量分析。 在土壤生態(tài)學(xué)中變得日益重要的一個(gè)有效方法就是 CLPP（群落水平生理學(xué)模型）。 一個(gè)微生物群落對(duì)它的利用方式可以潛在的提供這個(gè)群落的功能信息，也可以獲得多樣性參數(shù)，例如 H’或者分解代謝的多功能性。此外，用這種方法不能檢測(cè)出真菌對(duì)土壤功能的作用。 圖 5 地表植物 對(duì)于土壤微生物群的代謝平均度的影響 一個(gè)長(zhǎng)期爭(zhēng)論的問(wèn)題是 ： 多樣性是否與生產(chǎn)力相關(guān)，特別是植物產(chǎn)量。 Yan等發(fā)現(xiàn)有機(jī) C 和功能多樣性之間存在一個(gè)斷棍的關(guān)系，并且他們也重新計(jì)算了 Sharma 等給出的數(shù)據(jù)，該作者曾經(jīng)說(shuō)發(fā)現(xiàn)了H’和微生物生物量 之間存在線性關(guān)系。 圖 6 到了某個(gè)頂 點(diǎn)，功能多樣性（ H’）隨著土壤中微生物量和 /或有機(jī) C 的增加而 單調(diào)遞增。 4 檢測(cè)微生物多樣性的分子生物學(xué)方法 土壤微生物多樣性通常都是由像可行的培養(yǎng)方法、 CLPP 和流式細(xì)胞儀等這些方法來(lái)分析。一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)就是當(dāng)在顯微鏡下觀察土壤細(xì)菌時(shí) ，看到的大部分是活的 ， 但是在瓊脂平板上卻不能形成可見(jiàn)的菌落。這些技術(shù)提供了一種更加精確的土壤微生物多樣性程度衡量方法。這一部分綜述了現(xiàn)在研究土壤微生物群落的一些分子學(xué)方法的潛力和缺陷。 圖 7 縱覽分析微生物群落的非培養(yǎng)的分子生物方法。例如， 細(xì)菌人工染色體載體可以用來(lái)直接從土壤微生物群落中克隆大片段的 DNA。 中等分辨率的 方法包括系統(tǒng)發(fā)育探針的應(yīng)用，或者是群落 DNA 或者 RNA 的空位或者點(diǎn)墨法雜交，或者是完整的細(xì)胞熒光原位雜交。 其他的中等分辨率的 方法是基于保守基因的序列差異，例如編碼的核糖體 RNA、所謂的 rDNA。 8 擴(kuò)增的結(jié)果或者用來(lái)限制性分析或者基于變性或構(gòu)象性質(zhì)進(jìn)行分離。 Osborn等曾發(fā)現(xiàn) rRNA 的基因的 TRFLP 的峰可以用來(lái)區(qū)分鞘氨醇單胞菌 屬的物種。 TRFLP 和群落指紋印跡技術(shù) [變性 /溫度梯度凝膠電泳（ DGGE/TGGE）；單鏈結(jié)構(gòu)多態(tài)性（ SSCP） ]，這些基于分離 PCR 擴(kuò)增的 rRNA 和rDNA 分子的技術(shù)已經(jīng)被成功的用來(lái)分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。這些方法適合于在種和亞種的水平上區(qū)別和鑒定微生物菌株。 5 用總基因組 DNA 方法來(lái)分析生物多樣性 土壤微生物群落的組成情況可以通過(guò)檢測(cè)群落 DNA 的堿基差異 [摩爾 %鳥嘌呤 +胞嘧啶（ %G+C） ]來(lái)獲得。用一個(gè)恒溫的試管在慢慢加熱的條件下 ,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定 260nm 處的吸光度來(lái)檢測(cè) DNA 的解鏈。即使 這種方法被認(rèn)為分辨率很低，但是它可以用來(lái)指示整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)的整個(gè)變化，尤其是多樣性很低的情況。 雙苯酰亞胺優(yōu)先與 AT 堿基對(duì)結(jié)合，這會(huì)使 DNA 的浮力密度降低。這種方法有一個(gè)缺陷 ,就是兩個(gè)具有相似堿基差異的群落不一定有相似的物種組成，這是因?yàn)椴煌奈锓N經(jīng)常有相似的堿基組成。因此，這個(gè)方法可以用來(lái)大致的反應(yīng)干擾條件下微生物群落組成的變化。這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在 沒(méi)有被 檢測(cè)和分析 到 片段的情況下 ，群落中的一些非優(yōu)勢(shì)微生物通過(guò) PCR就可能檢測(cè)不出來(lái)。當(dāng)在低于其解鏈點(diǎn)溫度大概 25℃ 時(shí)單鏈 DNA 再退火，變性的比率就指示這個(gè)遺傳復(fù)雜性。重聯(lián)的 DNA 部分可以通過(guò) C0t 值 來(lái)反映，其中 C0是指摩爾核苷酸每升， t 是指以秒計(jì)算的時(shí)間。 圖 8 給出了一個(gè)適于耕種土壤中微生境 9 群落 DNA的 C0t 曲線的 例子。 用 未處理的天然土壤作為對(duì)照。為了估計(jì)土壤群落 DNA 的大小，使群落 DNA 的 C0t1/2除以 B 基因組 DNA 的 C0t1/2， 然后再乘以 B 基因組 的大小。 未受干擾的土壤 DNA 其C0t1/2 值 是 6300 摩爾每秒每升，相當(dāng)于大約 8000 個(gè)不同的大腸桿菌基因組。這分別相當(dāng)于 3200 和 340 個(gè)不同的大腸桿菌基因組。這使得兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的群落可能具有一致的 C0t1/2值 。vre229。低分辨率 整體分析群落的遺傳可能性，比較分析全部的生物多樣性 摩爾 %G+C 組成 群落遺傳圖譜，整個(gè)群落組成。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構(gòu)，群落組成的時(shí)間和空間的變化 PCRSSCP 個(gè)別條帶測(cè)序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢(shì)群落成員的聯(lián)系，中等分辨率 比較分析群落結(jié)構(gòu)，群落組成的時(shí)間和空間的變化 PCRTRFLP 群落組成，優(yōu)勢(shì)群落成員的相對(duì)數(shù)量豐度。低分類學(xué)水平的測(cè)定，高分辨率 比較分析微生物種群動(dòng)力學(xué)，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCRRISA 種群或者系統(tǒng)發(fā)育組的遺傳指紋圖譜，同時(shí)分析不同的微生物屬，在物種或?qū)俚乃缴蠝y(cè)定。高分辨率 群落成員的系統(tǒng)發(fā)育多樣性 功能基因 PCR克隆并測(cè)序 功能多樣性。中等分辨率 定性和定量分析群落中具有代謝活性的種群， 活的群落成員的系統(tǒng)發(fā)育信息 熒光原位雜交 代謝活性的微生物的檢測(cè)和確切的計(jì)算。nstad等 . 1996。nen 等 . 1998）。因此，必須使用一種間接地 DNA 提取方法將土壤中的細(xì)菌分離開(kāi)，即在細(xì)胞溶解之前進(jìn)行分級(jí)離心。從土壤微生物 群落中提取的 DNA 通常很復(fù)雜，重聯(lián)率也很低，但是如果在檸檬酸鹽溶液和 30%DMSO 中測(cè)量時(shí)它將會(huì)提高。 大片段的土壤群落 DNA（ 100kb）不用 PCR 擴(kuò)增就可以直接克隆進(jìn) BAC 載體。在理論上，BAC 文庫(kù)可以 容納全部的微生物群落基因組，并且可以用來(lái)繪制基因組圖譜、篩選特殊物種、評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育分析和功能多樣性。這種方法的一 個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不要通過(guò) PCR 擴(kuò)增，因而避免了許多其他指紋識(shí)別和測(cè)序技術(shù)中這一步驟的缺陷。 所以，土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育和功能之間的關(guān)聯(lián)信息可以通過(guò)克隆體的結(jié)合研究來(lái)隱藏 rRNA，功能性的基因則可以通過(guò)克隆和雜交 來(lái)獲得。 基于 rRNA 的方法已經(jīng)顯示了原核微生物中高度發(fā)散的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系， 它代表了地球上 絕大多數(shù)的遺傳多樣性。他們表明來(lái)自相似棲息環(huán)境不同地理區(qū)域的微生物有相關(guān)性，但是 具有相同官能團(tuán)的微生物可能屬于不同的系統(tǒng)發(fā)生組（親緣型），這反映了生態(tài)位的不同。 6 土壤微生物群落的遺傳指紋圖譜和通過(guò)比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫(kù)中的序 12 列來(lái)鑒定群落成員 基于 PCR 擴(kuò)增的遺傳指紋圖譜方法在分離擴(kuò)增物方法有很多不同的方法?；?PCR 的群落指紋圖譜技術(shù)有許多的優(yōu)點(diǎn)， 包括：快速，可以平行分析大量的樣品；可靠，高度的可重復(fù)性；提供一個(gè)群落里的種群的性質(zhì)和數(shù)量上的信息；可以通過(guò)比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列來(lái)評(píng)價(jià)群落成員之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。 用 DGGE 和 TGGE 的方法 PCR擴(kuò)增 rDNA 的 DNA指紋圖譜可以提供群落組成的信息。這種分離是基于 在一個(gè)線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中 PCR擴(kuò)增的 DNA分子具有不同的遷移率。具有不同序列的 DNA 分子在熔解時(shí)將會(huì)產(chǎn)生差異。部分變性的或者全部變性的分子停止在凝膠中遷移， DNA 片段由于不同的堿基組成和序列而在凝膠上占據(jù)不同的位置。前面的引物與富含 G+C 的序列（ GC夾子，通常達(dá) 40bp 長(zhǎng)度）相共價(jià)連接以阻止雙鏈全部解鏈。但是， 當(dāng)應(yīng)用于不是很復(fù)雜的群落時(shí)， 就可以 假設(shè)通過(guò) DGGE/TGGE 獲得的可辨別的條帶代表群落中的大量的優(yōu)勢(shì)微生物種群。分離較好的 DGGE 條帶可以從凝膠上切下來(lái)進(jìn)行測(cè)序。 DGGE/TGGE 方法分析 從反轉(zhuǎn)錄 PCR 的 rRNA 分子獲得的 PCR 擴(kuò)增物或許可以得出代謝活躍的微生物種群的指紋圖譜。 它們?cè)谡{(diào)查微生物群落空間和時(shí)間的差異時(shí)很方便，可以提供優(yōu)勢(shì)菌群的變化信息。在 SSCP 中，一個(gè)引物是在 5’端磷酸化的，并且擴(kuò)增物中磷酸化的鏈被 λ 核酸外切酶選擇性的酶切。這種優(yōu)化的凝膠限制雙鏈但是允許 DNA 鏈的分子內(nèi)部折疊。因此， DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變了單鏈 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移速率，從而使其被分辨出來(lái)。 SSCP 已經(jīng)被用于區(qū)別純培養(yǎng)的土壤微生物和不同植物不可培養(yǎng)的根圍微生物群落的群落指紋圖譜。除了 PCR 本身存在的誤差以外，這種方法的一個(gè)不足就是某一單個(gè)細(xì)菌物種可能 產(chǎn)生許多條帶，因?yàn)樵S多操縱子的存在或者單鏈 PCR 擴(kuò)增物有很多個(gè)構(gòu)象。這些 PCR 擴(kuò)增物通過(guò)使用引物連接到 rRNA 基因可變區(qū)附近的一致性序列而從微生物群落 DNA 獲得。然后擴(kuò)增物通過(guò)限制性酶切再進(jìn)行凝膠或者毛細(xì)管凝膠電泳分離。所以， TRFLP 結(jié)合了 PCR、 RFLP 和凝膠電泳三種技術(shù)。 這些分析方法已經(jīng)被用來(lái)區(qū)分群落和研究土壤中的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。 ARDRA 是在細(xì)菌鑒定和物種水平分類方面強(qiáng)有力的一個(gè)工具，它已經(jīng)被用來(lái)分類大批的分離株 和克隆物。限制性 酶切得到的片段通過(guò)自動(dòng) DNA 測(cè)序凝膠分離。 RISA 是基于 16S 和 23S rRNA 基因之間核糖體基因間隔區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性，這個(gè)間隔區(qū)的長(zhǎng)度具有菌株或者物種特異性，通常在 50bp 到 1500bp 之間。即使很相近的菌株，核糖體的非編碼間隔區(qū)大小和核苷酸序列都存在變化。 RISA的 自動(dòng)版本，叫做 ARISA，它使用 熒光標(biāo)記前端引物來(lái) PCR 擴(kuò)增內(nèi)部間隔區(qū)。同時(shí)使用許多引物靶標(biāo)相同樣品中的不同的系統(tǒng)發(fā)生基團(tuán)可以評(píng)估一個(gè)群落中的不同微生物種型的種群動(dòng)力學(xué)。在復(fù)雜的群落中，針對(duì)群落的一部分使用引物靶標(biāo)特殊 14 基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基團(tuán)（產(chǎn)甲烷的），可以利用基于 rRNA 的指紋圖譜技術(shù)來(lái)部分的分析群落。特殊引物也適用于檢測(cè)特殊基因，例如類芽孢桿菌，布克氏菌和桿菌。由 Vainio 和 Hantula 發(fā)現(xiàn)的真菌引物已經(jīng)被成功的用于研究熱帶玉米的田間和根圍土壤的真菌群落多樣性。 這種方法在研究功能性群體方面特別有效。探針的特異性取決于目標(biāo)序列的變化。土壤微生物群落主要親緣型的相對(duì)豐度可以用群落 DNA 數(shù)量點(diǎn)墨雜交或者通過(guò)基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行 FISH（熒光原位雜交）。 Amann和 Wagner 等提供了關(guān)于這方面的步驟和方法學(xué)的出色綜述。 已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)使用系統(tǒng)發(fā)育探針， 群落指紋圖譜的點(diǎn)跡和 Southern印跡雜交 在研究群落變化和鑒定大量 的優(yōu)勢(shì)群落成員時(shí)很有效。 在熒光原位雜交技術(shù)中，使用落攝式熒光顯微鏡即可看到被標(biāo)記的微生物。每個(gè)細(xì)胞的低生理活性往往與低核糖體含量有關(guān)，因此，低生長(zhǎng)率或者餓死的細(xì)胞就有可能檢測(cè)不出來(lái)。 FISH 已經(jīng)被用于鑒定不可培養(yǎng)的 微生物，研究微生物群落的分布和數(shù)量。 克隆 rRNA 基因分析 克隆技術(shù)可以替代指紋圖譜方法 來(lái)分析 PCR 擴(kuò)增物，并且已經(jīng)被廣泛的用來(lái)分析微生物群落。 15 細(xì)菌、真菌和古生菌的 rRNA 基因通過(guò)使用區(qū)域特異性和廣泛的引物 已經(jīng)被獨(dú)立的