【正文】 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出來(lái)。 然后通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育探針點(diǎn)墨印跡雜交鑒定這些克隆。 7 使用分子學(xué)方法在不同水平上評(píng)估農(nóng)業(yè)管理和污染對(duì)于土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響 不同的農(nóng)業(yè)管理和重金屬污染的土壤都使用群落結(jié)構(gòu)的多樣性和變化作為干擾和污染的 生態(tài)指標(biāo) 。這兩種土壤有相似的質(zhì)地（砂壤土），并且坐落于挪威西部 400 米遠(yuǎn)。 這在適于耕種土壤和有機(jī)土里面分別相當(dāng)于大約 340 和 8000 個(gè)不同的大腸桿菌基因組大小（ 106bp）的遺傳多樣性。 PCR 聯(lián)合 DGGE 顯示，這兩種 土壤中的不同細(xì)菌類(lèi)型的數(shù)量很高，這意味著這兩種土壤多樣性物種豐 度很高。這將導(dǎo)致很低的平均度，因此與牧地土壤相比耕種土壤的遺傳多樣性也很低。 沒(méi)有污染的土壤群落的 DNA 復(fù)雜度是 1010bp。金屬污染的土壤多樣性減少，并且與污染的程度有關(guān)。 低和高金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)是用基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行雜交得出的，包括 α變形菌（ ALF1b）、 β變形菌（ GAM42a） 、 δ變形菌（ SRB385）、嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細(xì)菌（ CF319a）、低 mole%（ G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌和高 mole%（ G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)大約 300 個(gè)克隆和 300 個(gè) 細(xì)菌群體一起進(jìn)行分析顯示，非培養(yǎng)方法（ FISH 和克隆分析）得出相似的結(jié)果，然而培養(yǎng)方法（孤立分析）卻顯示群落組成有很大的不同。 這個(gè)群體在低 金屬 污染的土壤中的豐富度是高 金屬 污染土壤的兩倍。關(guān)于孤立群， 3037%屬于低 mole%G+C 的革蘭氏陽(yáng)性菌。在重度金屬污染的土壤中孤立群的數(shù)量和 α變形菌亞綱的克隆變化明顯，克隆數(shù)比例是 38%，孤立群僅只有 14%。微生境調(diào)查顯示一些種群類(lèi)型在壓力條件下會(huì)變?yōu)閮?yōu)勢(shì)群體。結(jié)果顯示大量的微生物多樣性檢測(cè)和群落結(jié)構(gòu)分析方法可以區(qū)別不同程度污染的土壤，可以成為壓力和干擾的有效指標(biāo)。 全部細(xì)胞熒光原位雜交使用了屬特異性的 16S 和 23SrRNA 系統(tǒng)發(fā)育探針， PCR 擴(kuò)增的土壤中的總 16S 和23SrDNA 的 300 個(gè)克隆用點(diǎn)墨雜交。使用與以下系統(tǒng)發(fā)育屬的細(xì)菌相異的探針： α變形菌（ ALF1b）、 β變形菌（ GAM42a）、 δ變形菌（ SRB385）、嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細(xì)菌（ CF319a）、低 mole%（ G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌和高 mole%（ G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌。其中大多數(shù)的接種菌都由根瘤菌組成，其他的應(yīng)用有接種水稻 AzollaAnabaena、 谷類(lèi)作物 或者牧草 接種 azospirilli（主要有高粱、玉米、小麥）、 大量樹(shù)木接種菌 根真菌（例如柑橘、櫟樹(shù)、柳樹(shù)、椴樹(shù)、榛樹(shù)、楊樹(shù)、玉米、洋蔥等） 和桿菌、假單胞菌和木霉的物種用作生防制劑（例如植物保護(hù)劑抗病原菌，主要是真菌）。至今研究最多的轉(zhuǎn)基因微生物制 劑有根瘤菌屬、假單胞菌屬和固氮螺菌屬，這些細(xì)菌已經(jīng)被用來(lái)在田間規(guī)模做種子保護(hù)劑以測(cè)試其效果，也以此深入的研究其試用的安全相關(guān) 17 的方面，例如它們?cè)谕寥拉h(huán)境 中 的命運(yùn)。 標(biāo)記基因（ lacZY 和 kanrxylE） 被選作標(biāo)記以減少簡(jiǎn)單培養(yǎng)方法鑒定和檢測(cè)轉(zhuǎn)基因微生物的困難，它定位于 染色體的 1Mb 處以確保遺傳型和表型的穩(wěn)定，并且使與此兩種谷物相關(guān)的微生物種群的任何基因改變變得容易。隨后， De Leij 等作了研究 ，使用標(biāo)記基因 改造菌株后釋放進(jìn)田間， 調(diào)查插入基因 對(duì)各種組成成分生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力 潛在的代謝壓力 。因此，雖然轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在田間具有競(jìng)爭(zhēng)力，但是野生型的卻具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。除了能防治腐酶屬引起的枯萎病以外，它也能有效地防治馬鈴薯軟腐病病原菌 胡蘿卜軟腐歐文氏菌 亞種 和 馬鈴薯金線(xiàn)蟲(chóng) 。這個(gè)構(gòu)建的和原來(lái)的種群被用來(lái)研究熒光假單胞桿菌對(duì)土壤微生物群的影響。在任何土壤變動(dòng)下，轉(zhuǎn)基因標(biāo)記沒(méi)有影響任何的土壤酶活性（卡那霉素中加入乳糖）。 當(dāng)將 惡臭假單孢菌 WCS358r 和獨(dú)立的產(chǎn) 吩嗪 1羧酸 （抗菌復(fù)合物） 轉(zhuǎn)基因微生物 WCS358r::phr處理種子后，通過(guò) 重復(fù) ARDRA 產(chǎn)峰集中分析， 小麥根部的真菌種群發(fā)生變化。 微生物制劑的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)不同的國(guó)家都不一樣。包括歐盟至今都沒(méi)有一 個(gè)立法機(jī)構(gòu)。這些可以通過(guò)一系列的常規(guī)的工具和先進(jìn)的分子技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，這在其他的章節(jié)已有敘述。但是，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的潛在影響卻鮮有研究報(bào)道?；蛘哒f(shuō)是因?yàn)閷?duì)土壤微生物群的影響難以測(cè)定？ 轉(zhuǎn)基因植物會(huì)出現(xiàn)什么樣的影響？目前，在大規(guī)模使用轉(zhuǎn)基因植物對(duì)根圍和大部分土壤中微生物群落的影響方面，公認(rèn)的有兩種 推測(cè) ： 、抗細(xì)菌活性或其他的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，接近根部的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成什么時(shí)候會(huì)發(fā)生變化？ DNA，尤其是轉(zhuǎn)基因植物中作為標(biāo)記的抗性基因。 傳統(tǒng)的 育種 技術(shù)和遺傳改造一樣，可能會(huì)影響根圍土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，例如根的形態(tài)學(xué)和生理學(xué) 的變化、植物分泌物，這些可能影響植物有益微生物和有害微生物的平衡。但是， 評(píng)估轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致的微生物根圍群落潛在的轉(zhuǎn)移十分重要，基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)可以關(guān)聯(lián)自然浮動(dòng)的潛在變化。研究根圍和土壤細(xì)菌群落在時(shí)間上和空間上的變化，必需使用 分子生物技術(shù)分析大量的樣本。 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于根圍 微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能組成的影響在小規(guī)模水平的田間釋放研究比較理想 ，因?yàn)檠芯匡@示 ，溫室觀(guān)察與田間條件 存在很大的不同。 因?yàn)檫@些田間試驗(yàn)有足夠的重復(fù)可以分析和可以在不同的田間位置不同的植物生長(zhǎng)階段采集樣本，所以這也是研究父本變化和不同的轉(zhuǎn)化之間的 有無(wú) 潛在不同的理想田間試驗(yàn)。 至今，只有一少部分研究是關(guān)于分析田間條件下轉(zhuǎn)基因植物對(duì)根圍土壤的細(xì)菌群落組成的潛在影響的。 轉(zhuǎn)基因耐草甘膦的油籽變種 Quest 看起來(lái)很獨(dú)特，并且其根圍微生物群落與其他的三種耐草銨磷和四種常規(guī)的油籽的根圍微生物群落不同。但是，鑒于轉(zhuǎn)基因變種 Quest 沒(méi)有與其 未轉(zhuǎn)基因的父本作對(duì)照，所以這種差異是否是由遺傳改造引起尚不清楚。與許多其他的轉(zhuǎn)基因植物相比， D252。此外，研究證實(shí)根部檢測(cè)到有釋放的 T4 熔解酵素，導(dǎo)致根表面有殺菌的能力。細(xì)菌群落用了三種不同的方法分析，以達(dá)到互補(bǔ)的目的。第二種方法是使用 Biolog GN 微平板分 析群落分解代謝的功能單元。這種方法可以檢測(cè)根圍細(xì)菌同生群的變化，既包括 不易培養(yǎng)的細(xì)菌又包括不可培養(yǎng)的細(xì)菌。 在某些情況下，檢測(cè)到的某些樣品中的一個(gè)或者其他所有的品種的根圍群落結(jié)構(gòu)差異不是由于產(chǎn)生 T4 熔解酵素，而是極有可能與品種的成長(zhǎng)特征不同有關(guān)。 Heuer 等在研究中使用的方法似乎特別適合檢測(cè)根圍微生物群落變化 ，由于它很容易檢測(cè)出根圍微生物群落的季節(jié)性變化。通過(guò) FAME方法可以分離鑒定土壤中的優(yōu)勢(shì)菌，可以提供根圍細(xì)菌群落的可培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌的分類(lèi)學(xué)組成。最適合這種研究的方法似乎是 D/TGGE，它們可以通過(guò)非培養(yǎng)的方法 來(lái)分析大量的樣品并且鑒定不同的條帶。 但是，這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)與自然條件變化無(wú)關(guān)。（由于環(huán)境影響已經(jīng)排除，所以結(jié)果更能說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物群落的影響。自然轉(zhuǎn)化 是指有能力的細(xì)菌可以通過(guò)敏感性的 DNA酶來(lái)獲得自由 DNA的過(guò)程。自然轉(zhuǎn)化 提供了一個(gè)有能力的細(xì)菌通過(guò)獲得其周?chē)?DNA 來(lái)產(chǎn)生遺傳多樣性的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制。 Demaneche 等最近 20 發(fā)現(xiàn)可以自然轉(zhuǎn)化 的細(xì)菌數(shù)量比估計(jì)的要多。 但是，關(guān)于像在土壤、堆肥、糞便和污物等不同的環(huán)境條件下，細(xì)菌或植物的 DNA 的自然轉(zhuǎn)化 有多重要，至今仍然不清楚。 不同的課題組研究顯示，盡管 DNA 酶普遍存在，但是不同條件下都可以檢測(cè)到高分子的自由 DNA。不同的有生命的和無(wú)生命的因素似乎影響土壤中自由 DNA 的存留時(shí)間，并且關(guān)于最近出版了關(guān)于非無(wú)菌 土壤中的 DNA 存留的一些報(bào)告。 Nielsen等證實(shí) 熒光假單胞菌、 洋蔥伯克霍德菌 和 不動(dòng)細(xì)菌屬 的細(xì)胞熔解產(chǎn)物是在無(wú)菌的和非無(wú)菌的土壤中轉(zhuǎn)化 DNA 的可用原材料，并且細(xì)胞殘骸保護(hù) DNA 以防止在土壤中失活，在這過(guò)程中細(xì)胞壁或許在細(xì)胞死后起著重要的作用。在高溫高濕條件下轉(zhuǎn)基因 DNA 減少得更快。 Gebhard 和 Smalla 等在田間釋放具有轉(zhuǎn)基因 抗叢根病的甜菜然后研究其轉(zhuǎn)基因DNA 在土壤中的留存。其中的一部分在兩年后仍可以檢測(cè)到。 隨著植物的衰老和土壤中微生物對(duì)于植物殘?bào)w的降解，轉(zhuǎn)基因 DNA 也能隨著被降解。長(zhǎng)時(shí)間的留存會(huì)似乎會(huì)加強(qiáng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化的可能性，即使是植物釋放的 DNA 的一小部分。作者指出，兩種 DNA 似乎可以增加轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)散： 成長(zhǎng)的根部系統(tǒng)和花粉。 由于植物 DNA 可以吸附在土壤顆粒上或者被植物細(xì)胞所保護(hù)，所以這些 DNA 可以讓植物殘?bào)w附近附著定植的有能力的細(xì)菌所捕獲。大量的非細(xì)菌 DNA和植物 DNA 的 高甲基化速率被認(rèn)為是阻止抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物向細(xì)菌轉(zhuǎn)移 的因素。但是最近人們證實(shí)，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)室條件下，基于同源重組， Aciobacter sp. BD413 pFG4ΔnptII可以捕獲和整合轉(zhuǎn)基因植物的 DNA。而且對(duì)于含有 10bp 被刪除的 nptII 基因的 Aciobacter 細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從各種各樣的攜帶 nptII 標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因植物 （例如馬鈴薯、煙草、甜菜、 甘藍(lán)型油菜 和番茄）中轉(zhuǎn)化 DNA 會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌基因組整合不完整的 nptII 基因。 有報(bào)道稱(chēng)，青枯病的引誘劑 —— 青枯病菌可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)化能力并且可以在植物中交換遺傳信息。但是，在剛開(kāi)始種植轉(zhuǎn)基因植物時(shí)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。但是，如何評(píng)定此發(fā)現(xiàn)的意義？首先，觀(guān)察這種基因轉(zhuǎn)移的頻率是很重要的。 通過(guò)甜菜 DNA 轉(zhuǎn)化 Aciobacter 在無(wú)菌土壤中可以檢 測(cè)到，但是在非無(wú)菌土壤中就檢測(cè)不到。 經(jīng)過(guò)研究證實(shí)，在缺少重要的同源 DNA 的情況下往細(xì)菌基因組中整合轉(zhuǎn)基因的可能性很低。然而， 不能排除 像 土壤中型動(dòng)物區(qū)系 的消化管這樣的可以基因轉(zhuǎn)化 的 熱點(diǎn)的出現(xiàn)的可能性 。 自然轉(zhuǎn)化的主要限制性因素是有能力的細(xì)菌的出現(xiàn)和其能力的發(fā)展。但是， Nielsen 等發(fā)現(xiàn)，棲居土壤中的沒(méi)有實(shí)力的 Aciobacter 細(xì)胞在增加營(yíng)養(yǎng)后會(huì)變成有能力的細(xì)胞。 目前，關(guān)于野外環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)化過(guò)程的重要性我們所了解的依然很少。 不能排除不同的環(huán)境生態(tài)位中發(fā)生植物和細(xì)菌之間的基因水平轉(zhuǎn)移，但是這種稀有事件的生態(tài)影響取決于其本身已具有的特性的選擇和散播。例如像可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等這 樣的遺傳移動(dòng)元件在細(xì)菌種群間的抗性基因擴(kuò)散方面具有很重要的作用，并且導(dǎo)致了大量的具有抗性的病原菌的出現(xiàn)。關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物使用的抗性基因的流行，目前 很少有人提供研究的相關(guān)數(shù)據(jù)。 具有抗性的細(xì)菌不僅僅在醫(yī)院環(huán)境里有，在野外環(huán)境樣品和食物中也很容易分離到。在評(píng)估抗生素抗性問(wèn)題方面，抗生素本身的特性和抗生素抗性特點(diǎn)被認(rèn)為是重要的因素。但是，水平基因轉(zhuǎn)移沒(méi)有固定 的結(jié)果，除非有外界的選擇壓力。 毫無(wú)疑問(wèn)，現(xiàn)在人類(lèi)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)上的問(wèn)題是由于在 醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)中 毫無(wú)限制的使用抗生素 造成的，而不是由于使用攜帶抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物所造成。 11 討論 關(guān)鍵的問(wèn)題是 生物多樣性的減少會(huì)不會(huì)對(duì)地球上的生命有任何的影響。 這突出了像熱帶雨林、珊瑚礁等這種復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的弱點(diǎn)。事實(shí)上，生態(tài)理論廣泛的適用于地上系統(tǒng)。 在土壤中存在某些功能的冗余和重復(fù)，因此，土壤微生物多樣性的減少一般不會(huì)改變土壤過(guò)程的速率，例如 C 和 N 的礦化。 鑒定所有的土壤中的微生物物種不僅是個(gè)難題而且可能對(duì)于我們加深了解微生物多樣和土壤功能之間的關(guān)系沒(méi)什么幫助。從另一方面說(shuō)，檢測(cè)土壤中所有的微生物活性并且將其整合列一個(gè)表以在數(shù)量上評(píng)估土壤代謝活力是很難的。 作為人為影響土壤微生物多樣性的一個(gè)例子，我們集中于研究轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)土壤微生 物群的影響。事實(shí)上，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于微生物群落 23 的相關(guān)影響比與季節(jié)、田地位置和年份等環(huán)境因素引起的一般變化會(huì)更加深遠(yuǎn)。但是，轉(zhuǎn)基因抗叢根病的甜菜的組成部分可以在土壤中留存兩年。但是，當(dāng)這個(gè)過(guò)程發(fā)生時(shí)，觀(guān)察到的轉(zhuǎn)化頻率是很低的。 由于一個(gè)基因一種蛋白的說(shuō)法太過(guò)單純，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄和翻譯水平都可以發(fā)生改變，并且調(diào)控可以在蛋白質(zhì)翻譯水平發(fā)生，所以， DNA 和 mRNA 的檢測(cè)應(yīng)該結(jié)合蛋白組學(xué)的方法的應(yīng)用以測(cè)定土壤中蛋白的表達(dá)。 鑒于復(fù)雜的食物網(wǎng)會(huì)增強(qiáng)土壤應(yīng)對(duì)外界干擾的彈力，我們應(yīng)該 采取積極的行動(dòng)以保證高的微生物多樣性，盡管測(cè)定土壤中的微生物多樣性仍然很