【正文】 壤相比較，在過(guò)去的十年中單獨(dú)使用牧場(chǎng)地。 由各種技術(shù)得出的無(wú)污染的污泥改良的土壤微生物多樣性與 （ 低和高的金屬濃度 ）金屬污染 許多年 的污泥處理的田間土壤比較，一方面， 這三種處理得出的堿基組成很相似；另一方面， 由 DNA:DNA 重聯(lián)檢測(cè)出的總遺傳多樣性是不同的。低金屬污染的土壤中嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細(xì)菌群體數(shù)量最為豐富。污染會(huì)導(dǎo)致土壤群落結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化。其他的微生物制劑有應(yīng)用潛力的現(xiàn)在主要有 生物修復(fù)和植物修復(fù)、磷酸鹽增溶、土壤集聚、污物處理、生物浸取、油恢復(fù)、 煤炭擦洗和生產(chǎn)生物氣體。 就功能基因而言，分離自甜菜的熒光假單胞桿菌 F113 菌株能產(chǎn)生抗生素 DAPG。 當(dāng)引入的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較高時(shí)，主要的影響發(fā)生在田間試驗(yàn)的初期；轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)真菌種群的組成比 WCS358r 的影響時(shí)間要持久。 是不是人們覺得轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物種群的影響可以忽略，或者說(shuō)至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性 18 問(wèn)題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對(duì)非靶標(biāo)生物的影 響或者新的病毒的出現(xiàn)。 最近，人們報(bào)道了很多研究，他們使用了分子指紋圖譜技術(shù)來(lái)分析植物生 長(zhǎng)過(guò)程中根圍的動(dòng)力學(xué)和植物物種對(duì)根圍相關(guān)的細(xì)菌群落 豐富度的影響，觀察到在植物生長(zhǎng)過(guò)程中根圍微生物群落的相關(guān)豐 度發(fā)生巨大的變化。 其他變種 19 的差異似乎主要是由土壤類型的影響。在第一種方法中，根圍細(xì)菌種類的相對(duì)豐度的檢測(cè)是基于培養(yǎng)方法，然后用脂肪酸方法分析每個(gè)孤立群的特性。盡管只有細(xì)菌群落中的一小部分與 Biolog類型有關(guān)，但是細(xì)菌群落的分解代謝潛能的差異可以定性定量的檢測(cè)出來(lái)。） 10 土壤中 DNA 的留存和轉(zhuǎn)基因植物 DNA 與細(xì)菌之間的橫向轉(zhuǎn)移 自然轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因植物基因與細(xì)菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的最可能機(jī)制。目前，眾多 課題組 對(duì)于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化 主要有兩方面： （ 1）自由 DNA 可以持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間，例如在土 壤中；這些 DNA 依然可用于自然變換么？ （ 2） 在環(huán)境條件下不同的細(xì)菌物種有多少能達(dá)到可以自然變換的狀態(tài)？ 實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物 DNA 轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的另外一條可能途徑。 這兩種因素對(duì)土壤微生物活性都具有重要的影響。 在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬 鈴薯的根圍經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)表達(dá) T4 熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。還觀察到，不僅轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 而且轉(zhuǎn)基因植物的勻漿都修復(fù)了 317bp 的刪除，這將導(dǎo)致具有抗卡那霉素特性的 Aciobacter 的出現(xiàn)。 與染色體或者質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化相比，當(dāng)起始就過(guò)濾轉(zhuǎn)化 Aciobacter 的實(shí)驗(yàn)更深一步并且在無(wú)菌和非無(wú)菌土壤中進(jìn)行時(shí)，與植物 DNA 或植物勻漿之間的轉(zhuǎn)化頻率會(huì)劇烈的下降。在關(guān)于轉(zhuǎn)化的絕大多數(shù)研究中，有能力的細(xì)菌已經(jīng)被加入到被研究的土壤中去了。因 22 為細(xì)菌可以在不同的環(huán)境和不同的地理區(qū)域之間傳播，人們需要獲得 細(xì)菌抗性的全球性流行的 數(shù)據(jù)，選擇和擴(kuò)散比以前有了更加廣泛的途徑。 事實(shí)上：（ 1）通常位于遺傳移動(dòng)元件上抗性基因在細(xì)菌種群間廣泛的存在；（ 2）轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn)移被認(rèn)為概率極低 ， 并且在田間條件下檢測(cè)不到，因此說(shuō)明，似乎使用具有抗性基因的植物并不會(huì)嚴(yán)重的影響抗性基因在細(xì)菌之間的擴(kuò)散。 盡管使用分子生物方法可以 較好的鑒定土壤中微生物多樣性，但是關(guān)于微生物多樣性和土壤功能性之間的關(guān)系仍然不是很清楚。 一般情況下轉(zhuǎn)基因植物并不會(huì)影響細(xì)菌群的組成，并且即使當(dāng)觀察到有影響時(shí)，它們也與自然變動(dòng)無(wú)關(guān)。這種結(jié)合的方法可以更好的理解微生物多樣性和土壤功能之間的聯(lián)系。必須強(qiáng)調(diào)的是，公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭(zhēng) 論并不能轉(zhuǎn)移人們對(duì)于引起細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學(xué)上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過(guò)量使用抗生素。測(cè)定限制整個(gè)土壤代謝速率的反應(yīng)速率可以減少實(shí)驗(yàn)的工作量，并且不會(huì)影響評(píng)估土壤代謝活力。 May等沒(méi)有把這種理論應(yīng)用于微生物群落，但是這不能說(shuō)明它不適用。細(xì)菌本身的遺傳可 塑性是抗生素抗性出現(xiàn)的一個(gè)很大的原因。 由于人類大規(guī)模的使用抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌抗性的出現(xiàn)并且快速的發(fā)展。 現(xiàn)在關(guān)于自然轉(zhuǎn)化過(guò)程的不同步驟已經(jīng)研究得很透徹了，從細(xì)胞 DNA 的釋放到它的留存到它被有能 力的細(xì)菌整合的可用性。一個(gè)關(guān)于 從轉(zhuǎn)基因植物到細(xì)菌之間發(fā)生 抗性基因的水平轉(zhuǎn)移的 新發(fā)現(xiàn)是通過(guò)用細(xì)菌的同源重組從轉(zhuǎn)基因植物中捕獲 DNA。許多人 之所以 沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn) 移，大概是因?yàn)榧?xì)菌中缺 21 少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細(xì)菌。但是，實(shí)測(cè)到轉(zhuǎn)基因植物 DNA 卻可以躲過(guò)這些降解過(guò)程。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 有長(zhǎng)時(shí)間的留存。 自然轉(zhuǎn)化 的前提是，可用的自由 DNA；競(jìng)爭(zhēng)性的生長(zhǎng)；獲取并穩(wěn)定的整合捕獲的 DNA。 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關(guān)。因此，轉(zhuǎn)基因?qū)τ诩?xì)菌群落的影響風(fēng)險(xiǎn)似乎比原來(lái)預(yù) 見的要低。產(chǎn) T4 熔解酵素兩排，一排是沒(méi)有 T4 熔解酵素基因的和另一排 父本，在兩個(gè)相距很遠(yuǎn)的田間位置和不同的土壤類型的情況下，連續(xù)觀察了 3 年多。在 Dunfield 和 Germida 的研究中，他們?cè)诩幽么笏膫€(gè)不同的地區(qū)分別種植了四種耐除草劑的和四種常規(guī)的 油籽，然后用 FAME 和 Biolog CLPP 來(lái)分析其兩季的根圍土壤群落特性。如前所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。 9 轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響 過(guò)去的十年中人們使用了大量的轉(zhuǎn)基因植物，并且許多轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商品化。 然而，關(guān)于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒(méi)有直接涉及微生物多樣性的問(wèn)題，大多數(shù)集中于其他風(fēng)險(xiǎn) 評(píng)估方面的，例如它們?cè)诃h(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。但是卡那霉素抗性不影響生物適應(yīng)性，其他的兩種標(biāo)記則減少了生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力。對(duì)于縮寫，見圖 7 8 轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)微生物群落的影響 微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用超過(guò)每年 3 億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于 1896 年（知名的根瘤菌，用來(lái)接種豆科植物）或者 19 世紀(jì) 30 年代（例如蘇 云金芽孢桿菌，用來(lái)生物防治無(wú)脊椎害蟲）。 這些調(diào)查顯示，在相對(duì)干擾和污染較少的土壤中的總微生物多樣性很高，然而經(jīng)過(guò)干擾和污染的土壤中的總微生物多樣性卻劇烈的減少。 這些探針適用于總細(xì)菌群落（ FISH），細(xì)菌單體和基于 PCR的 16S rRNA克隆文庫(kù)（空位印跡雜交）。 由于含有一定數(shù)量的優(yōu)勢(shì)菌群和并且許多只是低豐度，耕種土壤的菌群可能要比牧地土壤的 分布更加不均勻。對(duì) 這些克隆的 rRNA 基因進(jìn)行測(cè)序 ， 然后與數(shù)據(jù)庫(kù)中的進(jìn)行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。為了克服這個(gè)缺陷，人們采用了一種 酪胺信號(hào)放大技術(shù) 用于 FISH，該技術(shù)可以分析緩慢生長(zhǎng)的微生物。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料 標(biāo)記然后用來(lái)做環(huán)境樣品的單細(xì)胞的原位檢測(cè) （整個(gè)細(xì)胞雜交）。評(píng)估真菌多樣性一直是一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槭褂玫囊锟梢酝瑫r(shí)擴(kuò)增其他真核生物的 DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。這種方法成功地被用來(lái)分類菌株和指紋鑒定簡(jiǎn)單的群落和混合的種群。除了基于 持家基因（例如rDNA）的分析， TRFLP 也被用來(lái)分析像汞抗性基因這樣的功能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。 TRFLP方法是基于對(duì)末端熒光標(biāo)記的 PCR擴(kuò)增物進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。 完整的鏈通過(guò)在非變性條件下（低溫）優(yōu)化的 SSCP 聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。群落的分類學(xué)組成信息可以通過(guò)凝膠印跡和與遺傳分子探針雜交、靶標(biāo)細(xì)菌和古生菌中的主要的系統(tǒng)發(fā)育亞種。 DGGE 依靠變性物質(zhì)（尿素和甲酰胺）的濃度梯度，而 TGGE 卻基于溫度梯度。 Tiedje 等質(zhì)疑微生物是世界性的這個(gè)假說(shuō)，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個(gè) 取樣點(diǎn)微生物的基因型都是特異性的。這可以通過(guò)與特殊探針進(jìn)行雜交、遺傳指紋識(shí)別和測(cè)序來(lái)實(shí)現(xiàn)。 C0代表摩爾核苷酸每升， t 代表時(shí)間 /秒 為了估計(jì)原核生物的多樣性， DNA必須高度純化并且與真核生物的 DNA區(qū)分開來(lái)。高分辨率 比較分析微生物種群動(dòng)力學(xué)，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCR of rDNA克隆和測(cè)序 系統(tǒng)發(fā)育多樣性，群落組成鑒定。 圖 8 大腸桿菌的 DNA 的重新組合（ C0t，其中 C0代表摩爾核苷酸每升， t代表時(shí)間 /秒），或未處理土壤中的細(xì)菌部分（ K），厭氧條件下的土壤（ N2）和 CH4作為主要碳源的土壤（ CH）（ 216。由于復(fù)雜性已知 [ 106堿基對(duì) （ bp） ]， B 基因組 DNA 的重聯(lián)速率作為標(biāo)準(zhǔn)曲線（表 1）。 從微生物群落分離出來(lái)的 DNA 復(fù)雜性是對(duì)總遺傳多樣性的一個(gè)估計(jì)。 DNA堿基組成曲線圖也可以通過(guò)笨亞甲胺 DNA 復(fù)合物在氯化銫梯度下等密度梯度離心來(lái)獲得。 高等分辨率的方法包括非編碼 DNA 區(qū)域的指紋識(shí)別（例如 repPCR擴(kuò)增重復(fù)性序列）和 編碼區(qū)及 非編碼區(qū)的測(cè)序。 這些方法可以用 來(lái)確定目標(biāo)微生物的數(shù)量和測(cè)定微生物群落的全部的分類學(xué)組成。 這些微生物核苷酸信息可以用來(lái)觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。在那種情況下，斷棍模型給出了最好的解釋（圖6）。這種方法采用了包含 95 種 C 源的微平板。當(dāng)然 ， 這對(duì)于特殊的功能是不使用的， 例如線蟲能抵抗燕麥全蝕病菌。 Griffiths 等證實(shí)，當(dāng)土壤微生物多樣性很低時(shí)，面對(duì)短時(shí)間的壓力（短時(shí)間 40℃ ）微生物功能性恢復(fù)受到消極的影響。 圖 4 資源不均一性假說(shuō) （ Tilman 1982），在地域、區(qū)域和全球規(guī)模的角度。所以，高多樣性的群落會(huì)更加穩(wěn)定。 MacArthur 在 1995 年發(fā)表的一篇關(guān)于動(dòng)物種群波動(dòng)和穩(wěn)定性衡量的文獻(xiàn)中假設(shè)，群落穩(wěn)定性將 會(huì)隨著食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)而增加，而不是某一物種的個(gè)體生態(tài)學(xué)特性。土壤 在很大程度上是典型的巨大的分層生境，有不同水平層次的 范圍，每一個(gè)范圍都可以視為一個(gè)獨(dú)立的整體。 ShannonWeaver 指數(shù)（ H’） 通常以以下形式使用： H’=Σ(ni/N)log(ni/N)=Σpi(logpi) 根據(jù) Odum 的觀點(diǎn) ， ni是指 每個(gè)物種的重要值， N 是指總的重要值， ni是指每個(gè)物種的重要性概率（ ni/N）。 2 土壤微生物多 樣性和功能多樣性和生態(tài)學(xué)理論的作用 迄今為止 ， 生態(tài)學(xué)理論一直致力于研究地上系統(tǒng)。本篇綜述即整合了許多此次會(huì)議上演講者的 投稿 。 雖然由于城市化發(fā) 展、侵蝕、森林采伐和污染的蔓延，每年損失上百萬(wàn)公頃的土地，但是，這個(gè)問(wèn)題一直 沒(méi)有受到 應(yīng)有的重視 。物 2 種多樣性是指一定區(qū)域內(nèi)的物種的數(shù)量和豐 度，并且這里的物種是指 （事實(shí)上或者潛在的） 能夠種內(nèi)交配并繁殖產(chǎn)生形態(tài)相似的后代 的一群個(gè)體的集合。轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 隨著老化或者退化的植物體 或者花粉進(jìn)入土壤。 P. Nannipieri 摘要： 本文主要討論了三個(gè)相關(guān)主題：生態(tài)學(xué)理論在土壤 研究方面的應(yīng)用，用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)衡量微生物多樣性以及轉(zhuǎn)基因植物、 轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)土壤遺傳多樣性的影響。 A. Benedetti土壤微生物多樣性對(duì)于很多土壤 功能具有決 定性的意義，但是在過(guò)去卻很難測(cè)定其主要成分。 但必須強(qiáng)調(diào)的是，公眾關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的討論不應(yīng)該把注意力轉(zhuǎn)移開細(xì)菌具有抗性的真正原因，例如醫(yī)生和畜牧業(yè)中的持續(xù)濫用和過(guò)量使用抗生素。 遺傳多樣性是指一個(gè)物種內(nèi)的基因和基因型的變化。 土壤微生物群的組成變化對(duì)土壤功能完整性很關(guān)鍵。 本文討論了檢測(cè)土壤微生物多樣性的許多分子生物學(xué)方法 ，尤其關(guān)注分子 生物學(xué) 工具和它們?cè)诜治鐾寥牢⑸锒鄻有苑矫娴木薮笞饔谩? 3 微生物多樣性通常被認(rèn)為是不同分類的生物個(gè)體的數(shù)量以及它們?cè)诜诸悓W(xué)中的分布。 在景觀水平上來(lái)講， 人們對(duì)多樣性的定義有不同的看法。另外，在土壤中，多樣性的空間變化跟根圍和大塊土、大塊土壤和顆粒土壤、大孔隙和小孔隙和不同的范圍等有著很重要的關(guān)系 我們 都知道有很多因素會(huì)影響多樣性 ，至少在理論上會(huì)影響。他對(duì)穩(wěn)定性的定義就是依據(jù)群落抵抗外界某一干擾的能力（圖 3）。我們將討論其中的資源不均一性假設(shè)和保險(xiǎn)假設(shè)。微生物多樣性和能源之間的關(guān)系尚不清楚，但是， 從 許多植物的特定微生物群 看來(lái)，由于微生物的資源不均一性增加所導(dǎo)致的植物多樣性的增加，微生物多樣性也會(huì)隨著增加。植物和動(dòng)物水平的結(jié)構(gòu)比土壤