【正文】 壤相比較，在過去的十年中單獨使用牧場地。 由各種技術得出的無污染的污泥改良的土壤微生物多樣性與 （ 低和高的金屬濃度 ）金屬污染 許多年 的污泥處理的田間土壤比較，一方面， 這三種處理得出的堿基組成很相似；另一方面， 由 DNA:DNA 重聯(lián)檢測出的總遺傳多樣性是不同的。低金屬污染的土壤中嗜纖維素菌 屈撓桿菌 似細菌群體數(shù)量最為豐富。污染會導致土壤群落結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化。其他的微生物制劑有應用潛力的現(xiàn)在主要有 生物修復和植物修復、磷酸鹽增溶、土壤集聚、污物處理、生物浸取、油恢復、 煤炭擦洗和生產(chǎn)生物氣體。 就功能基因而言，分離自甜菜的熒光假單胞桿菌 F113 菌株能產(chǎn)生抗生素 DAPG。 當引入的細菌數(shù)量相對較高時，主要的影響發(fā)生在田間試驗的初期；轉(zhuǎn)基因微生物對真菌種群的組成比 WCS358r 的影響時間要持久。 是不是人們覺得轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物種群的影響可以忽略，或者說至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性 18 問題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對非靶標生物的影 響或者新的病毒的出現(xiàn)。 最近，人們報道了很多研究，他們使用了分子指紋圖譜技術來分析植物生 長過程中根圍的動力學和植物物種對根圍相關的細菌群落 豐富度的影響，觀察到在植物生長過程中根圍微生物群落的相關豐 度發(fā)生巨大的變化。 其他變種 19 的差異似乎主要是由土壤類型的影響。在第一種方法中，根圍細菌種類的相對豐度的檢測是基于培養(yǎng)方法，然后用脂肪酸方法分析每個孤立群的特性。盡管只有細菌群落中的一小部分與 Biolog類型有關，但是細菌群落的分解代謝潛能的差異可以定性定量的檢測出來。） 10 土壤中 DNA 的留存和轉(zhuǎn)基因植物 DNA 與細菌之間的橫向轉(zhuǎn)移 自然轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因植物基因與細菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的最可能機制。目前，眾多 課題組 對于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化 主要有兩方面： （ 1）自由 DNA 可以持續(xù)多長時間，例如在土 壤中；這些 DNA 依然可用于自然變換么？ （ 2） 在環(huán)境條件下不同的細菌物種有多少能達到可以自然變換的狀態(tài)？ 實驗室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物 DNA 轉(zhuǎn)化到細菌中的另外一條可能途徑。 這兩種因素對土壤微生物活性都具有重要的影響。 在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬 鈴薯的根圍經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)表達 T4 熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。還觀察到，不僅轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 而且轉(zhuǎn)基因植物的勻漿都修復了 317bp 的刪除，這將導致具有抗卡那霉素特性的 Aciobacter 的出現(xiàn)。 與染色體或者質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化相比，當起始就過濾轉(zhuǎn)化 Aciobacter 的實驗更深一步并且在無菌和非無菌土壤中進行時，與植物 DNA 或植物勻漿之間的轉(zhuǎn)化頻率會劇烈的下降。在關于轉(zhuǎn)化的絕大多數(shù)研究中，有能力的細菌已經(jīng)被加入到被研究的土壤中去了。因 22 為細菌可以在不同的環(huán)境和不同的地理區(qū)域之間傳播，人們需要獲得 細菌抗性的全球性流行的 數(shù)據(jù)，選擇和擴散比以前有了更加廣泛的途徑。 事實上：（ 1）通常位于遺傳移動元件上抗性基因在細菌種群間廣泛的存在；（ 2）轉(zhuǎn)基因植物和細菌之間的水平基因轉(zhuǎn)移被認為概率極低 ， 并且在田間條件下檢測不到，因此說明，似乎使用具有抗性基因的植物并不會嚴重的影響抗性基因在細菌之間的擴散。 盡管使用分子生物方法可以 較好的鑒定土壤中微生物多樣性，但是關于微生物多樣性和土壤功能性之間的關系仍然不是很清楚。 一般情況下轉(zhuǎn)基因植物并不會影響細菌群的組成，并且即使當觀察到有影響時，它們也與自然變動無關。這種結(jié)合的方法可以更好的理解微生物多樣性和土壤功能之間的聯(lián)系。必須強調(diào)的是，公眾對于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的爭 論并不能轉(zhuǎn)移人們對于引起細菌產(chǎn)生抗生素抗性的真正原因，例如醫(yī)學上和畜牧業(yè)中繼續(xù)濫用和過量使用抗生素。測定限制整個土壤代謝速率的反應速率可以減少實驗的工作量，并且不會影響評估土壤代謝活力。 May等沒有把這種理論應用于微生物群落，但是這不能說明它不適用。細菌本身的遺傳可 塑性是抗生素抗性出現(xiàn)的一個很大的原因。 由于人類大規(guī)模的使用抗生素，導致細菌抗性的出現(xiàn)并且快速的發(fā)展。 現(xiàn)在關于自然轉(zhuǎn)化過程的不同步驟已經(jīng)研究得很透徹了，從細胞 DNA 的釋放到它的留存到它被有能 力的細菌整合的可用性。一個關于 從轉(zhuǎn)基因植物到細菌之間發(fā)生 抗性基因的水平轉(zhuǎn)移的 新發(fā)現(xiàn)是通過用細菌的同源重組從轉(zhuǎn)基因植物中捕獲 DNA。許多人 之所以 沒有檢測到轉(zhuǎn)基因植物和細菌之間的水平基因轉(zhuǎn) 移，大概是因為細菌中缺 21 少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細菌。但是，實測到轉(zhuǎn)基因植物 DNA 卻可以躲過這些降解過程。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 有長時間的留存。 自然轉(zhuǎn)化 的前提是，可用的自由 DNA；競爭性的生長；獲取并穩(wěn)定的整合捕獲的 DNA。 轉(zhuǎn)基因植物對于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關。因此，轉(zhuǎn)基因?qū)τ诩毦郝涞挠绊戯L險似乎比原來預 見的要低。產(chǎn) T4 熔解酵素兩排，一排是沒有 T4 熔解酵素基因的和另一排 父本，在兩個相距很遠的田間位置和不同的土壤類型的情況下，連續(xù)觀察了 3 年多。在 Dunfield 和 Germida 的研究中，他們在加拿大四個不同的地區(qū)分別種植了四種耐除草劑的和四種常規(guī)的 油籽，然后用 FAME 和 Biolog CLPP 來分析其兩季的根圍土壤群落特性。如前所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。 9 轉(zhuǎn)基因植物對微生物群落的影響 過去的十年中人們使用了大量的轉(zhuǎn)基因植物，并且許多轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商品化。 然而，關于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒有直接涉及微生物多樣性的問題，大多數(shù)集中于其他風險 評估方面的，例如它們在環(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。但是卡那霉素抗性不影響生物適應性，其他的兩種標記則減少了生態(tài)競爭力。對于縮寫，見圖 7 8 轉(zhuǎn)基因微生物對微生物群落的影響 微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應用超過每年 3 億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于 1896 年（知名的根瘤菌，用來接種豆科植物）或者 19 世紀 30 年代（例如蘇 云金芽孢桿菌，用來生物防治無脊椎害蟲）。 這些調(diào)查顯示，在相對干擾和污染較少的土壤中的總微生物多樣性很高，然而經(jīng)過干擾和污染的土壤中的總微生物多樣性卻劇烈的減少。 這些探針適用于總細菌群落（ FISH），細菌單體和基于 PCR的 16S rRNA克隆文庫（空位印跡雜交）。 由于含有一定數(shù)量的優(yōu)勢菌群和并且許多只是低豐度，耕種土壤的菌群可能要比牧地土壤的 分布更加不均勻。對 這些克隆的 rRNA 基因進行測序 ， 然后與數(shù)據(jù)庫中的進行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。為了克服這個缺陷，人們采用了一種 酪胺信號放大技術 用于 FISH，該技術可以分析緩慢生長的微生物。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料 標記然后用來做環(huán)境樣品的單細胞的原位檢測 （整個細胞雜交）。評估真菌多樣性一直是一個問題，因為使用的引物可以同時擴增其他真核生物的 DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。這種方法成功地被用來分類菌株和指紋鑒定簡單的群落和混合的種群。除了基于 持家基因（例如rDNA）的分析， TRFLP 也被用來分析像汞抗性基因這樣的功能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。 TRFLP方法是基于對末端熒光標記的 PCR擴增物進行限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。 完整的鏈通過在非變性條件下（低溫）優(yōu)化的 SSCP 聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。群落的分類學組成信息可以通過凝膠印跡和與遺傳分子探針雜交、靶標細菌和古生菌中的主要的系統(tǒng)發(fā)育亞種。 DGGE 依靠變性物質(zhì)（尿素和甲酰胺）的濃度梯度，而 TGGE 卻基于溫度梯度。 Tiedje 等質(zhì)疑微生物是世界性的這個假說，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個 取樣點微生物的基因型都是特異性的。這可以通過與特殊探針進行雜交、遺傳指紋識別和測序來實現(xiàn)。 C0代表摩爾核苷酸每升， t 代表時間 /秒 為了估計原核生物的多樣性， DNA必須高度純化并且與真核生物的 DNA區(qū)分開來。高分辨率 比較分析微生物種群動力學，微生物系統(tǒng)發(fā)育或功能屬的多樣性 PCR of rDNA克隆和測序 系統(tǒng)發(fā)育多樣性，群落組成鑒定。 圖 8 大腸桿菌的 DNA 的重新組合（ C0t，其中 C0代表摩爾核苷酸每升， t代表時間 /秒），或未處理土壤中的細菌部分（ K），厭氧條件下的土壤（ N2）和 CH4作為主要碳源的土壤（ CH）（ 216。由于復雜性已知 [ 106堿基對 （ bp） ]， B 基因組 DNA 的重聯(lián)速率作為標準曲線（表 1）。 從微生物群落分離出來的 DNA 復雜性是對總遺傳多樣性的一個估計。 DNA堿基組成曲線圖也可以通過笨亞甲胺 DNA 復合物在氯化銫梯度下等密度梯度離心來獲得。 高等分辨率的方法包括非編碼 DNA 區(qū)域的指紋識別（例如 repPCR擴增重復性序列）和 編碼區(qū)及 非編碼區(qū)的測序。 這些方法可以用 來確定目標微生物的數(shù)量和測定微生物群落的全部的分類學組成。 這些微生物核苷酸信息可以用來觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。在那種情況下，斷棍模型給出了最好的解釋（圖6）。這種方法采用了包含 95 種 C 源的微平板。當然 ， 這對于特殊的功能是不使用的， 例如線蟲能抵抗燕麥全蝕病菌。 Griffiths 等證實，當土壤微生物多樣性很低時，面對短時間的壓力（短時間 40℃ ）微生物功能性恢復受到消極的影響。 圖 4 資源不均一性假說 （ Tilman 1982），在地域、區(qū)域和全球規(guī)模的角度。所以，高多樣性的群落會更加穩(wěn)定。 MacArthur 在 1995 年發(fā)表的一篇關于動物種群波動和穩(wěn)定性衡量的文獻中假設，群落穩(wěn)定性將 會隨著食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)而增加，而不是某一物種的個體生態(tài)學特性。土壤 在很大程度上是典型的巨大的分層生境，有不同水平層次的 范圍，每一個范圍都可以視為一個獨立的整體。 ShannonWeaver 指數(shù)（ H’） 通常以以下形式使用： H’=Σ(ni/N)log(ni/N)=Σpi(logpi) 根據(jù) Odum 的觀點 ， ni是指 每個物種的重要值， N 是指總的重要值， ni是指每個物種的重要性概率（ ni/N）。 2 土壤微生物多 樣性和功能多樣性和生態(tài)學理論的作用 迄今為止 ， 生態(tài)學理論一直致力于研究地上系統(tǒng)。本篇綜述即整合了許多此次會議上演講者的 投稿 。 雖然由于城市化發(fā) 展、侵蝕、森林采伐和污染的蔓延，每年損失上百萬公頃的土地，但是，這個問題一直 沒有受到 應有的重視 。物 2 種多樣性是指一定區(qū)域內(nèi)的物種的數(shù)量和豐 度，并且這里的物種是指 （事實上或者潛在的） 能夠種內(nèi)交配并繁殖產(chǎn)生形態(tài)相似的后代 的一群個體的集合。轉(zhuǎn)基因植物的 DNA 隨著老化或者退化的植物體 或者花粉進入土壤。 P. Nannipieri 摘要： 本文主要討論了三個相關主題：生態(tài)學理論在土壤 研究方面的應用，用分子生物學技術來衡量微生物多樣性以及轉(zhuǎn)基因植物、 轉(zhuǎn)基因微生物對土壤遺傳多樣性的影響。 A. Benedetti土壤微生物多樣性對于很多土壤 功能具有決 定性的意義，但是在過去卻很難測定其主要成分。 但必須強調(diào)的是，公眾關于轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因的討論不應該把注意力轉(zhuǎn)移開細菌具有抗性的真正原因，例如醫(yī)生和畜牧業(yè)中的持續(xù)濫用和過量使用抗生素。 遺傳多樣性是指一個物種內(nèi)的基因和基因型的變化。 土壤微生物群的組成變化對土壤功能完整性很關鍵。 本文討論了檢測土壤微生物多樣性的許多分子生物學方法 ，尤其關注分子 生物學 工具和它們在分析土壤微生物多樣性方面的巨大作用。 3 微生物多樣性通常被認為是不同分類的生物個體的數(shù)量以及它們在分類學中的分布。 在景觀水平上來講， 人們對多樣性的定義有不同的看法。另外，在土壤中，多樣性的空間變化跟根圍和大塊土、大塊土壤和顆粒土壤、大孔隙和小孔隙和不同的范圍等有著很重要的關系 我們 都知道有很多因素會影響多樣性 ，至少在理論上會影響。他對穩(wěn)定性的定義就是依據(jù)群落抵抗外界某一干擾的能力（圖 3）。我們將討論其中的資源不均一性假設和保險假設。微生物多樣性和能源之間的關系尚不清楚，但是， 從 許多植物的特定微生物群 看來，由于微生物的資源不均一性增加所導致的植物多樣性的增加，微生物多樣性也會隨著增加。植物和動物水平的結(jié)構(gòu)比土壤