【正文】 成分都考慮在內(nèi)。從傳統(tǒng) 的生境多樣性來看 似乎合理，所以這個概念也可能用于描述土壤微生物多樣性的概念。現(xiàn)在仍然不知道這些微生境多樣性是如何并入土壤整體的多樣性的。其中有消極的作用如壓力，積極的作用如資源多樣性或生物之間的相互影響（圖二）。 其 前提是 ， 在一個具有大量能量途徑的生態(tài)系統(tǒng)中單一物種的數(shù)量變化對其它物種的影響要比 在一個能量途徑少的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生相同變化時的影響要小。由于支持競爭性假設的實驗證據(jù)仍然存 有異議，所以 30 年后這場爭論依然沒有解決。根據(jù)的 May 的觀點，干擾應該用絕對值，這樣的話這兩個群落對于干擾受到的影響都是相同的。 該假設認為，隨著生境的平均質(zhì)量的提高，資源的空間變化性和多樣性也將增加，因此導致生產(chǎn)力和多樣性增加。 比如說， Hall 等發(fā)現(xiàn) 資源不均一性和植物多樣性之間存在一種駝背 形的關系。這種效應是由單個物種對波動的 反應、反應的非同步性程度和反應的具體形式所決定。在另一方面，在持久的壓力時沒有發(fā)現(xiàn)任何的恢復；但是對于持久的壓力微生物多樣性高的土壤比低的抵抗力要好。但是有一種共識就是 恒定的環(huán)境下極少數(shù)的物種對于生態(tài)系統(tǒng)功能是必需的，在變化的環(huán)境下大量的物種對于維持生態(tài)系統(tǒng)過程 穩(wěn)定性 很有必要。 這種功能只屬于單個物種（熒光假單胞桿菌）并且取決于單一的功能 —— 產(chǎn)生 2， 4DAPG。用 14C 標記的化合物監(jiān)測 C 氧化為 CO2或者用 15N 富集的化合物監(jiān)測土壤中 15N 的分布， 具有代表性的這兩個例子可以提供土壤生物過程的數(shù)量分析。 一個微生物群落對它的利用方式可以潛在的提供這個群落的功能信息，也可以獲得多樣性參數(shù)，例如 H’或者分解代謝的多功能性。 圖 5 地表植物 對于土壤微生物群的代謝平均度的影響 一個長期爭論的問題是 ： 多樣性是否與生產(chǎn)力相關，特別是植物產(chǎn)量。 圖 6 到了某個頂 點，功能多樣性（ H’）隨著土壤中微生物量和 /或有機 C 的增加而 單調(diào)遞增。一個強有力的證據(jù)就是當在顯微鏡下觀察土壤細菌時 ，看到的大部分是活的 ， 但是在瓊脂平板上卻不能形成可見的菌落。這一部分綜述了現(xiàn)在研究土壤微生物群落的一些分子學方法的潛力和缺陷。例如， 細菌人工染色體載體可以用來直接從土壤微生物群落中克隆大片段的 DNA。 其他的中等分辨率的 方法是基于保守基因的序列差異，例如編碼的核糖體 RNA、所謂的 rDNA。 Osborn等曾發(fā)現(xiàn) rRNA 的基因的 TRFLP 的峰可以用來區(qū)分鞘氨醇單胞菌 屬的物種。這些方法適合于在種和亞種的水平上區(qū)別和鑒定微生物菌株。用一個恒溫的試管在慢慢加熱的條件下 ,通過紫外分光光度計測定 260nm 處的吸光度來檢測 DNA 的解鏈。 雙苯酰亞胺優(yōu)先與 AT 堿基對結(jié)合，這會使 DNA 的浮力密度降低。因此，這個方法可以用來大致的反應干擾條件下微生物群落組成的變化。當在低于其解鏈點溫度大概 25℃ 時單鏈 DNA 再退火，變性的比率就指示這個遺傳復雜性。 圖 8 給出了一個適于耕種土壤中微生境 9 群落 DNA的 C0t 曲線的 例子。為了估計土壤群落 DNA 的大小，使群落 DNA 的 C0t1/2除以 B 基因組 DNA 的 C0t1/2， 然后再乘以 B 基因組 的大小。這分別相當于 3200 和 340 個不同的大腸桿菌基因組。vre229。中等分辨率 比較分析群落結(jié)構，群落組成的時間和空間的變化 PCRSSCP 個別條帶測序 群落遺傳指紋圖譜，優(yōu)勢群落成員的聯(lián)系，中等分辨率 比較分析群落結(jié)構，群落組成的時間和空間的變化 PCRTRFLP 群落組成，優(yōu)勢群落成員的相對數(shù)量豐度。高分辨率 群落成員的系統(tǒng)發(fā)育多樣性 功能基因 PCR克隆并測序 功能多樣性。nstad等 . 1996。因此，必須使用一種間接地 DNA 提取方法將土壤中的細菌分離開，即在細胞溶解之前進行分級離心。 大片段的土壤群落 DNA（ 100kb）不用 PCR 擴增就可以直接克隆進 BAC 載體。這種方法的一 個優(yōu)點是不要通過 PCR 擴增，因而避免了許多其他指紋識別和測序技術中這一步驟的缺陷。 基于 rRNA 的方法已經(jīng)顯示了原核微生物中高度發(fā)散的系統(tǒng)發(fā)生關系， 它代表了地球上 絕大多數(shù)的遺傳多樣性。 6 土壤微生物群落的遺傳指紋圖譜和通過比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫中的序 12 列來鑒定群落成員 基于 PCR 擴增的遺傳指紋圖譜方法在分離擴增物方法有很多不同的方法。 用 DGGE 和 TGGE 的方法 PCR擴增 rDNA 的 DNA指紋圖譜可以提供群落組成的信息。具有不同序列的 DNA 分子在熔解時將會產(chǎn)生差異。前面的引物與富含 G+C 的序列（ GC夾子，通常達 40bp 長度）相共價連接以阻止雙鏈全部解鏈。分離較好的 DGGE 條帶可以從凝膠上切下來進行測序。 它們在調(diào)查微生物群落空間和時間的差異時很方便，可以提供優(yōu)勢菌群的變化信息。這種優(yōu)化的凝膠限制雙鏈但是允許 DNA 鏈的分子內(nèi)部折疊。 SSCP 已經(jīng)被用于區(qū)別純培養(yǎng)的土壤微生物和不同植物不可培養(yǎng)的根圍微生物群落的群落指紋圖譜。這些 PCR 擴增物通過使用引物連接到 rRNA 基因可變區(qū)附近的一致性序列而從微生物群落 DNA 獲得。所以， TRFLP 結(jié)合了 PCR、 RFLP 和凝膠電泳三種技術。 ARDRA 是在細菌鑒定和物種水平分類方面強有力的一個工具，它已經(jīng)被用來分類大批的分離株 和克隆物。 RISA 是基于 16S 和 23S rRNA 基因之間核糖體基因間隔區(qū)的長度多態(tài)性，這個間隔區(qū)的長度具有菌株或者物種特異性，通常在 50bp 到 1500bp 之間。 RISA的 自動版本，叫做 ARISA，它使用 熒光標記前端引物來 PCR 擴增內(nèi)部間隔區(qū)。在復雜的群落中，針對群落的一部分使用引物靶標特殊 14 基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基團（產(chǎn)甲烷的），可以利用基于 rRNA 的指紋圖譜技術來部分的分析群落。由 Vainio 和 Hantula 發(fā)現(xiàn)的真菌引物已經(jīng)被成功的用于研究熱帶玉米的田間和根圍土壤的真菌群落多樣性。探針的特異性取決于目標序列的變化。 Amann和 Wagner 等提供了關于這方面的步驟和方法學的出色綜述。 在熒光原位雜交技術中，使用落攝式熒光顯微鏡即可看到被標記的微生物。 FISH 已經(jīng)被用于鑒定不可培養(yǎng)的 微生物，研究微生物群落的分布和數(shù)量。 15 細菌、真菌和古生菌的 rRNA 基因通過使用區(qū)域特異性和廣泛的引物 已經(jīng)被獨立的 PCR反應擴增出來。 7 使用分子學方法在不同水平上評估農(nóng)業(yè)管理和污染對于土壤微生物多樣性和群落結(jié)構的影響 不同的農(nóng)業(yè)管理和重金屬污染的土壤都使用群落結(jié)構的多樣性和變化作為干擾和污染的 生態(tài)指標 。 這在適于耕種土壤和有機土里面分別相當于大約 340 和 8000 個不同的大腸桿菌基因組大?。? 106bp）的遺傳多樣性。這將導致很低的平均度，因此與牧地土壤相比耕種土壤的遺傳多樣性也很低。金屬污染的土壤多樣性減少，并且與污染的程度有關。對大約 300 個克隆和 300 個 細菌群體一起進行分析顯示，非培養(yǎng)方法（ FISH 和克隆分析）得出相似的結(jié)果，然而培養(yǎng)方法（孤立分析）卻顯示群落組成有很大的不同。關于孤立群， 3037%屬于低 mole%G+C 的革蘭氏陽性菌。微生境調(diào)查顯示一些種群類型在壓力條件下會變?yōu)閮?yōu)勢群體。 全部細胞熒光原位雜交使用了屬特異性的 16S 和 23SrRNA 系統(tǒng)發(fā)育探針， PCR 擴增的土壤中的總 16S 和23SrDNA 的 300 個克隆用點墨雜交。其中大多數(shù)的接種菌都由根瘤菌組成，其他的應用有接種水稻 AzollaAnabaena、 谷類作物 或者牧草 接種 azospirilli（主要有高粱、玉米、小麥）、 大量樹木接種菌 根真菌（例如柑橘、櫟樹、柳樹、椴樹、榛樹、楊樹、玉米、洋蔥等） 和桿菌、假單胞菌和木霉的物種用作生防制劑（例如植物保護劑抗病原菌，主要是真菌）。 標記基因（ lacZY 和 kanrxylE） 被選作標記以減少簡單培養(yǎng)方法鑒定和檢測轉(zhuǎn)基因微生物的困難，它定位于 染色體的 1Mb 處以確保遺傳型和表型的穩(wěn)定，并且使與此兩種谷物相關的微生物種群的任何基因改變變得容易。因此，雖然轉(zhuǎn)基因細菌在田間具有競爭力，但是野生型的卻具有更強的競爭力。這個構建的和原來的種群被用來研究熒光假單胞桿菌對土壤微生物群的影響。 當將 惡臭假單孢菌 WCS358r 和獨立的產(chǎn) 吩嗪 1羧酸 （抗菌復合物） 轉(zhuǎn)基因微生物 WCS358r::phr處理種子后，通過 重復 ARDRA 產(chǎn)峰集中分析， 小麥根部的真菌種群發(fā)生變化。包括歐盟至今都沒有一 個立法機構。但是，關于轉(zhuǎn)基因植物對于土壤微生物群落的潛在影響卻鮮有研究報道。 傳統(tǒng)的 育種 技術和遺傳改造一樣，可能會影響根圍土壤微生物群落的結(jié)構和功能多樣性，例如根的形態(tài)學和生理學 的變化、植物分泌物，這些可能影響植物有益微生物和有害微生物的平衡。研究根圍和土壤細菌群落在時間上和空間上的變化，必需使用 分子生物技術分析大量的樣本。 因為這些田間試驗有足夠的重復可以分析和可以在不同的田間位置不同的植物生長階段采集樣本，所以這也是研究父本變化和不同的轉(zhuǎn)化之間的 有無 潛在不同的理想田間試驗。 轉(zhuǎn)基因耐草甘膦的油籽變種 Quest 看起來很獨特，并且其根圍微生物群落與其他的三種耐草銨磷和四種常規(guī)的油籽的根圍微生物群落不同。與許多其他的轉(zhuǎn)基因植物相比， D252。細菌群落用了三種不同的方法分析，以達到互補的目的。這種方法可以檢測根圍細菌同生群的變化，既包括 不易培養(yǎng)的細菌又包括不可培養(yǎng)的細菌。 Heuer 等在研究中使用的方法似乎特別適合檢測根圍微生物群落變化 ，由于它很容易檢測出根圍微生物群落的季節(jié)性變化。最適合這種研究的方法似乎是 D/TGGE，它們可以通過非培養(yǎng)的方法 來分析大量的樣品并且鑒定不同的條帶。（由于環(huán)境影響已經(jīng)排除，所以結(jié)果更能說明轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物群落的影響。自然轉(zhuǎn)化 提供了一個有能力的細菌通過獲得其周圍的 DNA 來產(chǎn)生遺傳多樣性的基因轉(zhuǎn)移機制。 但是，關于像在土壤、堆肥、糞便和污物等不同的環(huán)境條件下，細菌或植物的 DNA 的自然轉(zhuǎn)化 有多重要，至今仍然不清楚。不同的有生命的和無生命的因素似乎影響土壤中自由 DNA 的存留時間，并且關于最近出版了關于非無菌 土壤中的 DNA 存留的一些報告。在高溫高濕條件下轉(zhuǎn)基因 DNA 減少得更快。其中的一部分在兩年后仍可以檢測到。長時間的留存會似乎會加強細菌轉(zhuǎn)化的可能性，即使是植物釋放的 DNA 的一小部分。 由于植物 DNA 可以吸附在土壤顆粒上或者被植物細胞所保護，所以這些 DNA 可以讓植物殘體附近附著定植的有能力的細菌所捕獲。但是最近人們證實，在優(yōu)化的實驗室條件下，基于同源重組， Aciobacter sp. BD413 pFG4ΔnptII可以捕獲和整合轉(zhuǎn)基因植物的 DNA。 有報道稱，青枯病的引誘劑 —— 青枯病菌可以增強轉(zhuǎn)化能力并且可以在植物中交換遺傳信息。但是，如何評定此發(fā)現(xiàn)的意義？首先，觀察這種基因轉(zhuǎn)移的頻率是很重要的。 經(jīng)過研究證實，在缺少重要的同源 DNA 的情況下往細菌基因組中整合轉(zhuǎn)基因的可能性很低。 自然轉(zhuǎn)化的主要限制性因素是有能力的細菌的出現(xiàn)和其能力的發(fā)展。 目前，關于野外環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)化過程的重要性我們所了解的依然很少。例如像可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等這 樣的遺傳移動元件在細菌種群間的抗性基因擴散方面具有很重要的作用，并且導致了大量的具有抗性的病原菌的出現(xiàn)。 具有抗性的細菌不僅僅在醫(yī)院環(huán)境里有，在野外環(huán)境樣品和食物中也很容易分離到。但是，水平基因轉(zhuǎn)移沒有固定 的結(jié)果，除非有外界的選擇壓力。 11 討論 關鍵的問題是 生物多樣性的減少會不會對地球上的生命有任何的影響。事實上，生態(tài)理論廣泛的適用于地上系統(tǒng)。 鑒定所有的土壤中的微生物物種不僅是個難題而且可能對于我們加深了解微生物多樣和土壤功能之間的關系沒什么幫助。 作為人為影響土壤微生物多樣性的一個例子，我們集中于研究轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因微生物對土壤微生 物群的影響。但是，轉(zhuǎn)基因抗叢根病的甜菜的組成部分可以在土壤中留存兩年。 由于一個基因一種蛋白的說法太過單純，因為在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都可以發(fā)生改變，并且調(diào)控可以在蛋白質(zhì)翻譯水平發(fā)生，所以， DNA 和 mRNA 的檢測應該結(jié)合蛋白組學的方法的應用以測定土壤中蛋白的