【正文】 基于破壞生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳 安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系研究。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所、浙江大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 桂建芳 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 周莉、羅琛、汪洋、鄭康、李忠、李志、魏麗華 經(jīng)費(fèi)比例： 25% 課題 2 魚類生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類下丘腦 /垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；闡明腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚類肌肉細(xì)胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制出可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開拓生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基 因用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 2) 精干、務(wù)實(shí)的研究團(tuán)隊(duì)，成效突出： 本項(xiàng)目集中了中國科學(xué)院、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院、中山大學(xué)、浙江大學(xué)、武漢大學(xué)等相關(guān)科研單位和高等院校在本領(lǐng)域的優(yōu)秀人才，具有強(qiáng)烈的使命感和責(zé)任感，經(jīng)過五年的合作，已取得了相當(dāng)高的學(xué)術(shù)成績，主要學(xué)術(shù)帶頭人在項(xiàng)目執(zhí)行過程中發(fā)表了高水平的學(xué)術(shù)論文 ，有的還獲得國家杰出青年科學(xué)基金資助，已形成一支經(jīng)過磨練、對科學(xué)有執(zhí)著追求、精干、務(wù)實(shí)、高效的研究團(tuán)隊(duì)，成為本項(xiàng)目順利實(shí)施的人才保證。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補(bǔ)（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對一些重要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、并對其進(jìn)行泛素化、乙?；土姿峄刃揎椃治?； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動(dòng)子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。 采用大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 4）魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們在群體和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，輔以其它分子生物學(xué)方法如目的基因表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導(dǎo)處理等來分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。 3) 堅(jiān)實(shí)、完善的研究基地，支撐有力： 本項(xiàng)目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、有害生物控制和資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)部門重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室研究基地的研究條件，這些實(shí)驗(yàn)室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí)支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 主要研究內(nèi)容： 魚類下丘腦 /垂體的功能基因組以及魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理研究； 腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路和對魚類生長調(diào)控機(jī)制研究； 抑肌素信號調(diào)控在魚類肌肉細(xì)胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用機(jī)理研究； 可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系研制及其生理學(xué)功能分析； 魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律研究； 生長調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑研究。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計(jì)劃 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫構(gòu)建以及與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號表達(dá)水平改變對魚體肌肉生長的調(diào)控研 究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚 QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗(yàn)證； 7. 魚類生長和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長激素受體基因的分子設(shè)計(jì) ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測序。 子代親本 2020 尾以上；分析鯉魚 QTL或主效基因的聚合效應(yīng)、育種效率與潛力； 8. 獲得可用于原生殖細(xì)胞操作的、的基因操作載體 ， 獲得具有表型效應(yīng)的基因敲除的純合子個(gè)體； 9. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長激素受體基因魚 F2 代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞發(fā)育被影響的轉(zhuǎn)基因胚胎 ， 揭示小 RNA 及其互作蛋白和靶基因的相互作用。 重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子解析 貝類生長、發(fā)育、抗性和珍珠質(zhì)形成等是貝類 重要或特有的經(jīng)濟(jì)性狀，以功能基因組學(xué)為基礎(chǔ)，篩選上述性狀的關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的功能和調(diào)控機(jī)制，闡明基因?qū)π誀畹臎Q定機(jī)制，解析主要性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)。 分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)基礎(chǔ)研究 研究變溫動(dòng)物貝類的基因 表型關(guān)聯(lián)體系對環(huán)境變動(dòng)的反應(yīng) 效應(yīng)，建立基因型和表型性狀的 GP模型和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，開發(fā)分子育種計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，開展生長和抗逆性狀的復(fù)合 /聚合育種， 建立貝類分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)平臺(tái)，進(jìn)行 模擬育種與實(shí)際育種的 驗(yàn)證和相互促進(jìn) 。 良種分子設(shè)計(jì)理論和技術(shù)基礎(chǔ)研究 構(gòu)建 23 個(gè)主要育種性狀的 GP 模型； 實(shí)現(xiàn)生長和抗逆性狀的復(fù)合 /聚合育種，研發(fā)出計(jì)算機(jī)模擬育種技術(shù)， 構(gòu)建育種模擬技術(shù)平臺(tái)并進(jìn)行育種驗(yàn)證，輔助應(yīng)用于新品種的培育。通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜，對QTL 進(jìn)行精細(xì)定位，并解析基因 基因、基因 環(huán)境相互作用和基因與 QTL 對性狀表現(xiàn)的效應(yīng)，為分子育種提供理論和技術(shù)支持。 貝類抗病和抗逆的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 利用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)方法，基于牡蠣等全基因組序列信息篩查抗性相關(guān)候選基因；利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組技術(shù)、 RNA 干擾、 DNA 重組技術(shù)等鑒定主效基因，研究基因功能，建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控模型、表達(dá)特征和作用機(jī)理；應(yīng)用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，開展抗性相關(guān)的 QTL 定位，確定牡 蠣等經(jīng)濟(jì)貝類抗性候選功能基因與抗性性狀相關(guān)關(guān)系，并確定基因型和表型的關(guān)系。 核心技術(shù)研發(fā)已提前布局并獲可喜進(jìn)展 項(xiàng)目 組已先期開展相關(guān)的核心技術(shù)研究，在貝類大規(guī)?；蚪M、比較基因組分析技術(shù)、 SNP 高通量篩查檢測技術(shù)、基因克隆和功能分析技術(shù)，基因 性狀關(guān)聯(lián)分析技術(shù)等方面已獲可喜進(jìn)展；分子模擬育種技術(shù)已應(yīng)用 Quline 平臺(tái)開展了初步探索。項(xiàng)目建議的首席科學(xué)家與美、法等國科學(xué)家合作，領(lǐng)導(dǎo)了 “牡蠣基因組計(jì)劃（ OGP） ”研究。 課題 貝類基因組的比較與功能基因批量發(fā)掘 預(yù)期 目標(biāo)： 1）構(gòu)建牡蠣全基因組精細(xì)圖譜 ： 在原有的基因組框架圖的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建牡蠣全基因組精細(xì)圖譜 。 研究內(nèi)容： 1）貝類 SNP 的規(guī)模發(fā)掘 利用牡蠣 等貝類 基因組序列信息， 以 SOAP 等軟件 大規(guī)模篩選 SNP，利用各種不同通量的 SNP 分型技術(shù)開發(fā) SNP 標(biāo)記。 經(jīng)費(fèi)比例： % 承擔(dān)單位： 廈門大學(xué)、中國科學(xué)院海洋研究所 課題負(fù)責(zé)人： 黃河清 學(xué)術(shù)骨干： 陳軍、董波、黃輝洋、匡世煥、柳承璋、王德祥、王鴻霞、趙晶 課題 貝類抗病和抗逆的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 預(yù)期目標(biāo)： 1）功能基因 /QTL 分析 ：篩選和鑒定 70 個(gè)以上重要 抗性性狀相關(guān)的功能基因， 30 個(gè) QTL 并分析其效應(yīng)； 2）功能基因 鑒定 ： 明確 510 個(gè)重要抗性性狀關(guān)鍵基因的作用和調(diào)控機(jī)制；篩查 35 個(gè)功能 SNP 多態(tài)分子標(biāo)記，明確其對性狀的遺傳效應(yīng)，建立基因型與表型的關(guān)系。 2）珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因與珍珠質(zhì)量的相關(guān)性 ：從珍珠質(zhì)形成相關(guān)基因中發(fā)掘 SNP 標(biāo)記，確定等位基因型；分析 SNP 標(biāo)記基因型對珍珠珠層厚度和珍珠顏色的遺傳效應(yīng)，確定功能 SNP 基因型與珍珠質(zhì)量有關(guān)性狀的連鎖關(guān)系。 經(jīng)費(fèi)比例： % 承擔(dān)單位： 中國海洋大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 胡景杰 學(xué)術(shù)骨干： 黃曉婷、李琪、汪小龍、王昭萍、于瑞海、張志峰、鄭小東 四、年度計(jì)劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 （ 1）構(gòu)建牡蠣全基因組精細(xì)圖譜 。 （ 2） 篩選 生長發(fā)育等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因、 挖掘候選基因的SNP。 （ 1）完成基因功能注釋與分類 ， 得到完整的牡蠣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和表達(dá)譜信息； 完成理想高代作圖家系的構(gòu)建；開發(fā) SNP 標(biāo)記 15002020 個(gè)，微衛(wèi)星標(biāo)記 10002020 個(gè)。 （ 2） 篩查 、分析和克隆與貝類 生長發(fā)育 、抗 性性狀、 珍珠質(zhì)形成 相關(guān)基因， 構(gòu)建適合 QTL 定位和 SNP 多態(tài)性分子標(biāo)記功能分析的遺傳材料 、篩選模型。運(yùn)用碳酸鈣體外結(jié)晶和免疫金標(biāo)等方法研究 基質(zhì)蛋白在珍珠質(zhì)形成過程中的調(diào)控作用。 研究內(nèi)容： 1）抗病相關(guān)功能基因與表型相關(guān)關(guān)系、作用機(jī)制和調(diào)控機(jī)理 ：通過全基因組序列確定的抗病 /免疫相關(guān)基因，研究候選基因多態(tài)性，篩查 SNP 等 分子標(biāo)記；利用特定抗病的貝類樣本材料，采用連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等技術(shù)方法，開展 QTL 定位，確定貝類抗性候選功能基因與抗性性狀相關(guān)關(guān)系，進(jìn)行功能驗(yàn)證，分析研究其表達(dá)特征和作用機(jī)理，解析、闡明相關(guān)基因在抗性相關(guān)過程的調(diào)控規(guī)律和網(wǎng)絡(luò)途徑。 經(jīng)費(fèi)比例： % 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院海洋研究所、中國海洋大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 李莉 學(xué)術(shù) 骨干： 郭希明、胡曉麗、亓海剛、齊潔、邵明瑜、王海艷、吳富村 課題 貝類生長和發(fā)育的關(guān)鍵基因及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制 預(yù)期目標(biāo)： 1）功能基因 /QTL 分析 ：篩選和鑒定生長發(fā)育基因 70 個(gè)、 QTL30 個(gè)并分析其效應(yīng)。 3）構(gòu)建貝類基因組數(shù)據(jù)庫 ：可在線查詢貝類基因組序列、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、注釋基因、 SNP 及其定位信息、基因家族的基因拷貝數(shù)及分布，并提供同源比對等服務(wù)功能。 （五）課題設(shè)置 各課題間相互關(guān)系 針對基因組結(jié)構(gòu)和特征，設(shè)置 2 個(gè)課題，構(gòu)建基因組序列圖譜，批量開發(fā) SNP標(biāo)記和功能基因，構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。 項(xiàng)目組在貝類遺傳育種領(lǐng)域具有堅(jiān)實(shí)的研究積累 在國家 863 計(jì)劃、自然科學(xué)基金項(xiàng)目、支撐計(jì)劃等有關(guān)項(xiàng)目的支撐下，項(xiàng)目組在牡蠣等貝類的遺傳育種基礎(chǔ)理論研究和材料體系建設(shè) 方面 已取得豐碩成果，培育出 多 個(gè) 水產(chǎn)養(yǎng)殖 新品種 （系） 。 貝類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 利用 QTL定位、家系分析、遺傳環(huán)境方差組分分析，研究變溫動(dòng)物類型貝類的基因 表型關(guān)聯(lián)體系對環(huán)境變動(dòng)的反應(yīng)效應(yīng)；應(yīng)用混合線性方程和貝葉斯函數(shù)等數(shù)量遺傳學(xué)方法，建立基因型和表型性狀關(guān)聯(lián)的 GP模型，開發(fā)分子育種計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)和相應(yīng)數(shù)據(jù)庫；構(gòu)建基于 QuGENE和 Quline系統(tǒng)的貝類育種模擬信息平臺(tái)，通過模擬、篩選和優(yōu)化，提出最佳育種策略，開展生長和抗逆性狀的復(fù)合/聚合育種，建立分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)平臺(tái)。 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)為本項(xiàng)目研究提供了強(qiáng)有力的工具。發(fā)表 SCI 論文 200 篇，其中 10 篇影響因子 ，頂級刊物研究論文 12 篇，申請國家或國際發(fā)明專利 ?40 個(gè)。 構(gòu)建牡蠣的基因組精細(xì)圖譜，比較扇貝、珍珠貝和牡蠣的基因組差異；獲得批量 牡蠣、扇貝和珍珠貝功能基因和 SNP 標(biāo)記；構(gòu)建高密度遺傳圖譜。 分子設(shè)計(jì)育種的技術(shù)途徑 貝類育種的分子設(shè)計(jì)尚處于起步階段，亟待開展良種分子設(shè)計(jì)和預(yù)測模型的理論和技術(shù)研究，構(gòu)建模擬育種平臺(tái)，為分子設(shè)計(jì)育種提供技術(shù)支撐。 1. 重點(diǎn)闡明 23 個(gè)重要功能基因在殖質(zhì)的形成和遷移、卵子成熟、卵胚轉(zhuǎn)換和性別決定和性別分化的基因調(diào)控