【正文】 RA 易感基因、自身抗原特征、自身免疫反應(yīng)及免疫調(diào)控機(jī)制、炎癥和骨破壞發(fā)生發(fā)展機(jī)制，極大推進(jìn) RA 致病的免疫學(xué)機(jī)制的認(rèn)識，形成新的 RA 免疫致病機(jī)制理論；通過早期診斷靶標(biāo)及免疫干預(yù)方法的研究，解決 RA 早期診斷和免疫干預(yù)方法中的關(guān)鍵問題，使我國 RA 的基礎(chǔ)研究和臨床診斷與治療上形成自己的特色，達(dá)到國際水平。在前期工作基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目利用我們獨(dú)有的轉(zhuǎn)基因動物平臺和充足的臨床樣本來源，對不同亞型調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞在 CIA 及 RA 患者發(fā)病過程數(shù)量和功能的異常以及免疫 負(fù)調(diào)控機(jī)制、間充質(zhì)干細(xì)胞對 CIA 及 RA 患者 T細(xì)胞活化的抑制作用進(jìn)行了深入探討。1 項(xiàng)目名稱： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制及其干預(yù)策略的研究 首席科學(xué)家： 栗占國 北京大學(xué) 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 教育部 2 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題包括： 從 RA 發(fā)病過程的各環(huán)節(jié)，深入探討 RA 發(fā)病的免疫應(yīng)答及調(diào)控機(jī)制，尋找其中關(guān)鍵性分子，為 RA 早期診斷和免疫干預(yù)新策略的研究奠定基礎(chǔ) 。并在前期芯片篩選結(jié)果基礎(chǔ)上，對我們發(fā)現(xiàn)的新的 RA 相關(guān)小分子進(jìn)行研究，探討其對各種免疫細(xì)胞增殖和分化功能以及膠原性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 系統(tǒng)分析前期工作中新發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因、特征性 SNP 和 CNP 基因位點(diǎn)在中國人群 RA 患者中的遺傳易感性，并對其參與致病的免疫遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行闡述。 9. 闡明 RA 炎癥啟動、進(jìn)展和骨破壞過程中免疫細(xì)胞與滑膜細(xì)胞之間的相互作用及其分子機(jī)制。 其中對 RA 易感基因 等 RA 發(fā)病的免疫遺傳學(xué)機(jī)制研究對于闡明 RA 的遺傳特性和基因早期診斷及免疫干預(yù)策略研究具有重要意義。 2. 學(xué)術(shù)隊(duì)伍： 1）高水平的學(xué)術(shù)帶頭 人保證了項(xiàng)目研究方向的準(zhǔn)確性和研究方案的可行性。 12 2. 原創(chuàng)性研究基礎(chǔ)上的新層面的進(jìn)一步研究： 6 個課題均在團(tuán)隊(duì)大量前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)行，是針對團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)的 RA 新易感基因、新抗原和新型調(diào)控分子的作用及致病機(jī)制的系統(tǒng)研究，具有很強(qiáng)的原創(chuàng)性，能夠創(chuàng)造一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型臨床診斷和免疫干預(yù)新方法，具有重大的理論和臨床應(yīng)用價值。 本項(xiàng)目的六個課題均是圍繞 RA 發(fā)病機(jī)制中免疫異常、炎癥和組織破壞以及13 干預(yù)策略的關(guān)鍵問題進(jìn)行設(shè)置，各課題既有明確的研究方向，又有課題間的密切聯(lián)系。從分子、細(xì)胞、動物模型及患者外周血四個層面系統(tǒng)闡述上述新抗原的致病機(jī)制等。 4）新型 RA 中 HLADR4/1 特異性 修飾 抗原的篩選及其抗原表位的鑒定。 3） T細(xì)胞表面糖表位譜系對免疫應(yīng)答功能的影響。本課題將從分子、細(xì)胞及一系列基因敲除動物模型水平，利用抗體阻斷、 RNA 干擾和基因轉(zhuǎn)染等不同方法，系統(tǒng)闡述 Th17 等免疫細(xì)胞調(diào)控滑膜炎癥和骨破壞的分子通路。 2） RA 患者外周血 Treg 細(xì)胞的分布及致病作用研究。除了易感基因可做為診斷靶標(biāo)外，本研究團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)的一系列血清蛋白或抗原，甚至 miRNA 等均可做為新型診斷靶標(biāo)用于 RA 臨床。 2）變構(gòu)肽的體外篩選。 19 3）抗 Cyr61 人源化單克隆抗體的制備及對 RA 骨破壞的抑制作用研究。 8． 分析 RA 局部炎癥與滑液中炎癥因子對于滑膜細(xì)胞的作用，以及 RA 滑膜細(xì)胞所分泌的炎癥因子對于 RA 中 Th1 和 Th17 細(xì)胞的抗凋亡作用。 15． 測定篩選出的變構(gòu)肽對 RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的影響。 3． 闡明 RA 關(guān)節(jié)滑液中炎癥細(xì)胞亞群及其炎癥因子在 RA 滑膜炎癥的早期作用及相互調(diào)控機(jī)制，篩選 RA 炎癥細(xì)胞抗凋亡的調(diào)控機(jī)制和新分子。 11． 研究 OPGHSP 重組蛋白、 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽 。 6． 用 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對相應(yīng)的 T 細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或Vγ4T 細(xì)胞對關(guān)節(jié)炎的影響。 14． 對篩選出的變構(gòu)肽進(jìn)行豆蔻酸化修飾、鑒定。 3． 通過體內(nèi)試驗(yàn) 初步明確 γδT 細(xì)胞二個主要亞群在 RA 中的作用。 11． 總結(jié)首批測試結(jié)果，建立初步的 RA 和 HDAC 相關(guān)性假說，并將該假說反饋回 HDACi 分 子的設(shè)計(jì)和合成。 3． 深入研究 RAT細(xì)胞免疫生物學(xué)特點(diǎn)。 11． 檢測 MSCs 治療 CIA 模型 IL10/Foxp3 Tg 小鼠血清細(xì)胞因子水平，并分離小鼠脾細(xì)胞，分析各 T 細(xì)胞亞群的數(shù)量、細(xì)胞表型及體外活化功能。 18． 體外實(shí)驗(yàn)研究 OPGHSP 重組蛋白防治骨破壞和抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。 6． 明確 Th17 及其相關(guān)調(diào)控因子如 Cyr61 和 Wnt/DKK 對于 RA 滑膜炎癥和引起 骨質(zhì)破壞的現(xiàn)象。初步評 價針對其得特異性 siRNA 對小鼠 CIA 模型的治療作用。 5. 利用已有的 RA 實(shí) 驗(yàn)動物模型，過繼轉(zhuǎn)移針對活化態(tài) T 細(xì)胞的抗體，觀察其治療或者預(yù)防作用。分析小分子抑制26 物轉(zhuǎn)染前后 T 細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)水平。 20. 人源化 RANKL TNF 樣區(qū)單克隆抗體的制備 。 7. 明確 RA 炎癥性 滑膜和骨質(zhì)破壞的新分子和調(diào)控的初步途徑。 16. 力爭制備出針對 RANKL TNF 樣區(qū)的人源化單克隆抗體。 6. 通過對上述 RA 相關(guān)小分子功能研究，合成相應(yīng)的模擬物或抑制劑，分別轉(zhuǎn)染膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠動物模型，觀察其對小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)生和炎癥進(jìn)展的抑制作用。 （二）預(yù)期目標(biāo) 1. 通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)篩選理想的負(fù)調(diào)疫苗分子。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中的動態(tài)生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和數(shù)學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；并結(jié)合隨機(jī)動力學(xué)方程組對白血病細(xì)胞所處不同“平衡態(tài)”做出符合系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的詮釋； 、藥理作用機(jī)制詮釋、新型治療藥物發(fā)現(xiàn)和治療方案設(shè)計(jì)及臨床轉(zhuǎn)化研究 :利用 APL 細(xì)胞模型、動物模型和臨床樣本闡明 其在有效藥物 (全反式維甲酸和三氧化二砷 )處理過程中生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，運(yùn)用系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論深化對 APL 治療藥理作用的全面認(rèn)識，力爭發(fā)現(xiàn)白血病治療的一般規(guī)律和原理；重點(diǎn)進(jìn)行 AML－ M2b和 CML 靶向治療的研究，進(jìn)一步發(fā)展靶向治療的理論 ，研究天然產(chǎn)物冬凌草甲素和毛萼乙素對 AMLM2b 亞型細(xì)胞模型和動物模型的治療藥理作用，闡明這二種藥物或其衍生物對致病融合基因 AML1ETO 及其相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)AMLM2b 型白血病新型治療藥物奠定基礎(chǔ)；基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論為 CML 治療設(shè)計(jì)新 型治療方案，并探討其臨床轉(zhuǎn)化可行性；同時對生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子進(jìn)行系統(tǒng)性干預(yù)， 開展藥物靶標(biāo)篩選 和鑒定 。 5. 在國內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 3050 篇，出版專著 1－ 2 部，申請專利10－ 20 項(xiàng)。另外，基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究基礎(chǔ)上構(gòu)建 分子信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子，篩選和鑒定新型白血病治療靶標(biāo)，為開發(fā)新型藥物奠定基礎(chǔ)。 第四 年 1． 進(jìn)一步完善全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測和分析技術(shù)，并進(jìn)行 23 例腫瘤或白血病樣本檢測；其他新型組學(xué)技術(shù)用于白血病研究獲得更多數(shù)據(jù)； 2． 并在較大樣本（ 50100）腫瘤或白血病樣本評價基因組結(jié)構(gòu)異常的頻率，對較高頻率突變基因和結(jié)構(gòu)異常相關(guān)基因進(jìn)行臨床關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)一步評估突變基因和結(jié)構(gòu)異常相關(guān)基因在疾病發(fā)生發(fā)展中作為診斷指標(biāo)以及作為靶向治療指標(biāo)的意義；對較高頻率突變基因和結(jié)構(gòu)異常相關(guān)基因進(jìn)行深入功能研究，揭示其作為藥物靶標(biāo)的可能性； 3． 完善生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括 新理論用于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析，建立數(shù)學(xué)模型；尋找和鑒定一批（ 4050）關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)分子，有選擇對一些重要功能基因、節(jié)點(diǎn)分子進(jìn)行深入研究，探討其作為藥物靶標(biāo)的可能性；提供一批潛在候選藥物靶標(biāo)； 4． 新型藥物或治療方案用于少量病人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察治療效果；評價新型診斷指標(biāo)指導(dǎo)臨床方案的可行性； 5． 在國內(nèi)外一流學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 710 篇，申請專利 35 項(xiàng)。因此，進(jìn)一步明確幽門螺桿菌感染致胃癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)理，并從分子水平上評價干預(yù)效果，對篩選高危個體、有針對性開展預(yù)防具有重要意義。MG 1A COX EGR1/CYR61 是 本項(xiàng)目組以往發(fā)現(xiàn)的重要胃癌早診標(biāo)志物，但僅依靠單分子的預(yù)告模型無法達(dá)到臨床應(yīng)用的目的，利用基因組高通量手段可發(fā)現(xiàn)并鑒定更多的診斷標(biāo)志物，有助于提出更多、更好的用于分子診斷的策略。 39 項(xiàng)目名稱： 胃癌新標(biāo)志物的篩選及其預(yù)警和早診作用的 大規(guī)模人群研究 首席科學(xué)家： 樊代明 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 總后勤部衛(wèi)生部 40 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題包括： 胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多步驟的過程，涉及到大量的分子參與和復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控， 找出其中的關(guān)鍵分子，并確定為胃癌高危預(yù)警、早期診斷和有效治療的生物標(biāo)志物，是本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 。 2）技術(shù)路線： 1. 建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技 術(shù)平臺體系： 除了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀遺傳組和代謝組等系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)平臺技術(shù)以外，重點(diǎn)發(fā)展基于單細(xì)胞的納米分析技術(shù)方法和研究體系，結(jié)合物理學(xué)理論和進(jìn)化論等，開發(fā)新型生物信息相互作用網(wǎng)絡(luò)和演化的模擬技術(shù)； 2. 建立和完善白血病細(xì)胞模型、動物模型、藥物篩選技術(shù)體系以及臨床評價體系： 建立和完善 APL、 AMLM2b 和 CML 相應(yīng)的細(xì)胞模型和動物模型以及相應(yīng)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和整體評介體系；相關(guān)疾病患者樣本獲取、分離、純化等；建立和完善以復(fù)合細(xì)胞模型體系、為對象以生物反應(yīng)為指標(biāo)的藥靶篩選驗(yàn)證技術(shù)；建立和完善臨床 治療方案的評價體系等； 3. 白血病細(xì)胞生物信息組分解析、相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和動態(tài)演變分析并構(gòu)建數(shù)學(xué)模型： 利用系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)平臺體系對 APL、 AMLM2b和 CML相應(yīng)的細(xì)胞模型和動物模型以及患者樣本進(jìn)行多層次分析，解析其基因組變異以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀遺傳組和代謝組等特征；綜合所有“組學(xué)”數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)分析，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子，分析疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的動態(tài)演進(jìn)過程，并構(gòu)建計(jì)算機(jī)模擬體系和數(shù)學(xué)模型等； 4. 藥物靶標(biāo)分析和鑒定以及有效藥物作用模式分析： 以 APL細(xì)胞模型、動物模型和患者樣本為對象，利用有效藥物如全反式維甲酸和三氧化二砷聯(lián)合方案研究這兩種藥物對 APL細(xì)胞分子作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的藥理作用模式，闡明全反式維甲酸和三氧化二砷作為已知靶向治療藥物的作用機(jī)制及其毒副作用所涉及的分子及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等；重點(diǎn)以 AML－ M2b細(xì)胞35 模型、動物模型和患者樣本為對象，分析天然產(chǎn)物冬凌草甲素和毛萼乙素以及其衍生物對AMLM2b細(xì)胞分子作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的藥理作用模式；以 CML（包括急性變）細(xì)胞模型、動物模型和患者樣本為對象，基于以上構(gòu)建的生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)新型治療方案，并以 CML（包 括急性變）或 AML－ M2b細(xì)胞模型、動物模型和患者樣本為對象，試驗(yàn)新型治療方案的可行性；基于生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，利用干擾手段包括有效藥物、反義核酸 /RNAi等，分析關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子作為白血病治療藥物作用靶標(biāo)的可行性； 5. 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)原理的新型治療方案設(shè)計(jì)和臨床應(yīng)用： 通過對生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析基礎(chǔ)上的新型治療方案設(shè)計(jì)如有效藥物的聯(lián)合治療方案，通過充分動物試驗(yàn)后，對少量合適患者進(jìn)行應(yīng)用，獲得原理上的證據(jù)（ Proof of concept），為更大規(guī)模推廣奠定基礎(chǔ)。由于多種遺傳物質(zhì)變異導(dǎo)致了系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)節(jié)調(diào)控機(jī)制的失控，并逐漸形成不同于正常造血 細(xì)胞的強(qiáng)健（ robustness）的網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控體系，因此必須了解這個新體系中的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成元件以及其相互作用關(guān)系，即解析其生物分子信息的組份，包括基因組變異、表觀遺傳變異、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組成份以及這些分子信息所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制，利用計(jì)算生物學(xué)、物理學(xué)理論并結(jié)合進(jìn)化論觀點(diǎn)模擬網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子；并利用干預(yù)手段，包括有效藥物干預(yù)，了解系統(tǒng)的反應(yīng)模式，探討靶向治療、聯(lián)合治療方案和新型藥物開發(fā)的可行性并提供原理上證據(jù)（ Proof of concept）。除完善和發(fā)展基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)等高通量“組學(xué)”相關(guān)技術(shù)平臺外，還要研究和開發(fā)基于單細(xì)胞分離基礎(chǔ)上的全新研究策略以及蛋白組學(xué)芯片等新技術(shù)、新方法；發(fā)展計(jì)算機(jī)整合、模擬和疾病數(shù)學(xué)模型構(gòu)建方法；探討物理學(xué)理論、 進(jìn)化論等應(yīng)用于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究的可行性，為系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。 3. 闡明 RA 相關(guān) miRNA 分子調(diào)控免疫功能的機(jī)制研究 4. 明確可以用于 RA 早期診斷血清生物標(biāo)志分子及多肽。 8. 對血清生物標(biāo)志分子及 RA 相關(guān)多肽做為早期診斷靶標(biāo)的可行性進(jìn)行研究。 第五年度 （一）研究內(nèi)容 1. 體外合成的糖蛋白抗原的生物學(xué)測試。 9. 明確 RA 患者 Treg 與疾病活動度關(guān)系。 （二）預(yù)期目標(biāo) 1. 力爭鑒定出 RA 相關(guān)新型自身抗原。 1