【正文】 疫調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，為 RA 免疫干預(yù)策略提供新的靶向。 經(jīng)費(fèi)比例： 20% 承擔(dān)單位： 北京大學(xué)、南開大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 栗占國 學(xué)術(shù)骨干： 尹芝南、穆榮、洪章勇、何菁、葉華 課題 RA 易感基因及早期診斷靶標(biāo)研究 預(yù)期目標(biāo)： 鑒定 RA 新的易感基因、 miRNA 表達(dá)譜及新的血清蛋白標(biāo)志分子，尋找 RA新的生物靶標(biāo)用于臨 床早期診斷。 研究?jī)?nèi)容： 本課題將在項(xiàng)目組成員既往研究以及本項(xiàng)目前述研究基礎(chǔ)之上，針對(duì) RA 自身免疫反應(yīng)的啟動(dòng)、調(diào)控、炎癥反應(yīng)及骨破壞等四個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，探索 RA 干預(yù)的新策略，并通過與傳統(tǒng)緩解病變抗風(fēng)濕藥（ DMARDs）甲氨蝶呤比較，評(píng)價(jià)新型免疫治療策略的療效及安全性。 4. 新型生物制劑對(duì) RA 骨破壞的抑制作用研究 1） OPGHSP 重組蛋白對(duì) RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 6． T 細(xì)胞二個(gè)亞群（ Vγ1/Vγ4）產(chǎn)生 IFNγ 和 IL4 的分子機(jī)制研究。 14． 對(duì)項(xiàng)目組前期發(fā)現(xiàn)的 RA 關(guān)聯(lián) SNP 進(jìn)行進(jìn)一步基因定位工作，并在大樣本中驗(yàn)證。 21 （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 爭(zhēng)取 獲得多個(gè) RA 相關(guān)的新的候選抗原和表位。 9． 完成 ClassI， ClassIIa， ClassIIb 和 ClassIV 的代表性 HDAC 同功酶的同源模建和結(jié)構(gòu)優(yōu)化工作。 4． 糖表位特異性抗體和抗 T 細(xì)胞抗體作用于 RAT 細(xì)胞后導(dǎo)致其表型和功能變化的體外實(shí)驗(yàn)。 12． 上調(diào)或下調(diào) RA 相關(guān)小 分子的表達(dá)，分析其對(duì)各種免疫細(xì)胞活化及分化功能的影響。 （二）預(yù)期目標(biāo) 1． 爭(zhēng)取獲得多個(gè) RA 自身抗原。 9． 確定豆蔻酸化變構(gòu)肽的免疫學(xué)功能。 第三年度 （一）研究?jī)?nèi)容 1． 檢測(cè) RA 自身抗原的修飾特點(diǎn)。 9． 利用從 IL10/Foxp3 Tg 小鼠獲得的不同亞群 Treg細(xì)胞，探討不同亞型 Treg對(duì) CIA 動(dòng)物模型的治療作用。 17． 利用 siRNA 檢測(cè)下調(diào) RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)對(duì) RA 細(xì)胞炎性反應(yīng)及自身抗原的免疫反應(yīng)的作用。 4． 成功鑒定 RAT 細(xì)胞膜表面葡聚糖基化修飾的膜翻轉(zhuǎn)異位抗原。 13． 明確不同亞群 Treg 細(xì)胞對(duì)初次和再次免疫應(yīng)答的調(diào)控作用研究，及在此作用中小分子化合物對(duì)免疫反應(yīng)的干預(yù)作用。 3. 合成并純化目標(biāo)表位肽，體外刺激分析其對(duì) T/B 細(xì)胞功能的影響。 11. 分析 Cyr6 Wnt/DKK1 途徑對(duì)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì) 胞的成長(zhǎng)、細(xì)胞侵蝕能力、細(xì)胞移行能力的影響。 18. 探討使用 RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn) siRNA 治療的 CIA 小鼠的病理變化、免疫反應(yīng)特點(diǎn)。 5. 了解 RAT 細(xì)胞表面膜翻轉(zhuǎn)異位抗原誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性抗體產(chǎn)生的機(jī)制，提出新假說。 27 14. 了解 RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)特異性 siRNA 對(duì) CIA 小鼠的治療效果；闡明其發(fā)揮作用的免疫學(xué)機(jī)理。 4. 利用 IL6/IL8 基因敲除小鼠，觀察 Th17 及其炎癥因子、 Cyr61 和 Wnt/DKK1對(duì) CIA 模型的影響。 13. 人源化 RANKL TNF 樣區(qū)單克隆抗體對(duì) RA 模型保護(hù)性作用及其機(jī)制的研究。 8. 力爭(zhēng)獲得低免疫原性、高親和力的 Cyr61 人源化抗體，為 RA 的免疫干預(yù)提供新干預(yù)靶點(diǎn)和手段，并為進(jìn)入中試生產(chǎn)工藝和臨床研究申報(bào)奠定基礎(chǔ)。 3. 建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)平臺(tái)和技術(shù)體系，研究和開發(fā)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相關(guān)新技術(shù)、新模型和新理論。另外 CML 治療雖然有一定進(jìn)展，如針對(duì) BCRAbl 融合蛋白的 伊馬替尼 (imatinib)有一定效果，但逐漸發(fā)現(xiàn)有耐藥發(fā)生，因此必須發(fā)展其他治療方案，前期研究 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)理論設(shè)計(jì)新型治療方案， 顯示伊馬替尼 (imatinib)和硫化砷（ arsenic sulfide）合用具有協(xié)同作用。 第三 年 1． 啟動(dòng)白血病或腫瘤全 基因組 全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)和分析體系 。根除幽門螺桿菌感染能明顯降低重度癌前病變及胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。 5． 胃上皮細(xì) 胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的效應(yīng)分子與調(diào)控機(jī)制 胃癌發(fā)生呈明顯的階段性變化，伴隨發(fā)生的分子事件眾多，除可用于診斷和預(yù)警的分子標(biāo)志物外，本課題組以往的研究還提示存在一些關(guān)鍵的效應(yīng)分子，對(duì)這些過程中的關(guān)鍵因素進(jìn)行阻斷可逆轉(zhuǎn)胃上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程，明確這些關(guān)鍵因素有助于提出可用于干預(yù)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，達(dá)到早期治療的目的。 關(guān)鍵標(biāo)志物的篩選炎性改變癌前病變?cè)缙谖赴┻M(jìn)展轉(zhuǎn)移致病因素宿主因素異常分子表觀修飾惡性轉(zhuǎn)化惡性表型正常細(xì)胞 圖 2 胃癌發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)示意圖 本項(xiàng)目圍繞以上六個(gè)與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行胃癌標(biāo)志物的篩選 （見圖 2），具體科學(xué)問題是： 1．幽門螺桿菌致癌過程中的關(guān)鍵因子 41 幽門螺桿菌可導(dǎo)致胃癌風(fēng)險(xiǎn)增高已得到公認(rèn)，但不同幽門螺桿菌菌株感染，給予宿主的刺激信號(hào)不同，導(dǎo)致其致病作用不同，但對(duì)何種菌株、那些基因在胃粘膜癌變過程中可引起惡性表型及其具體機(jī)制卻有待于明確，同時(shí)在此過程密切相關(guān)的幽門螺桿菌特異毒素蛋白的功能及相關(guān)機(jī)制也有待闡明，這對(duì)闡明幽門螺桿菌相關(guān)性胃癌遺傳標(biāo)志，對(duì)于胃癌高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體預(yù)警以及幽門螺桿菌有效干預(yù)具有重要意義。 第二 年 1． 進(jìn)一步 完善系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)體系：尤其 全 基因組 外顯子突變檢測(cè)和分析技術(shù)；完善 表觀遺傳組等 技術(shù)體系； 初步建立全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)和分析技術(shù)體系 。 AMLM2b 型白血病是更為常見的疾病，盡管基礎(chǔ)研究已經(jīng)獲得很大進(jìn)展，但臨床上 還停留在聯(lián)合化療階段，近年來雖然治療緩解率較高，但復(fù)發(fā)、死亡率仍然居高不下，預(yù)后較差。 （二）五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 構(gòu)建白血病 APL 和 AMLM2b 以及 CML 亞型發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中動(dòng)態(tài)生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，并建立 1種以上白血病亞型的數(shù)學(xué)模型。 6. 了解 RA 相關(guān)炎癥新靶點(diǎn)在 RA 自身免疫發(fā)生中的調(diào)控作用。 11. 評(píng)價(jià)雙靶向 HDACi 分子治療 RA 的效果。其免疫原性與靶蛋白比較。 11. 阻斷自身免疫反應(yīng)的激活治療 RA 的實(shí)驗(yàn)研究 12. 了解變構(gòu)肽治療對(duì) CIA 小鼠模型的免疫系統(tǒng)的影響，了解其發(fā)揮作用的免疫學(xué)機(jī)理。 3. 明確 T 細(xì)胞表位特異性應(yīng)答與疾病相關(guān)性。 16. 娃兒藤堿類似物 對(duì) CIA 鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用研究 ， 研究小分子化合物在關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療中作用。 9. 研究 IL17 與 Cyr61 表達(dá)對(duì)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成與功能的作用。 第四年度 （一）研究?jī)?nèi)容 1. 鑒定與 RA 相關(guān)的新型自身抗原在 RA 發(fā)病過程中的免疫學(xué)特性和功能。 11． 力爭(zhēng)篩選出多個(gè) RA 關(guān)聯(lián)基因和 CNP，闡明其致病機(jī)制。 2． 系統(tǒng)分析其 TCR 特異性、表達(dá)水平以及 ZAP70 等信號(hào)途徑改變。 15． 檢測(cè)小分子化合物對(duì) CII 免疫后不同階段 CIA 小鼠中 Treg 亞群數(shù)量，格局和功能的改變。 7． 采用小鼠軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，研究阻斷 Cyr61 后對(duì)于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)與維持的影響。 15． 闡明 IL17RC 可溶性多肽抑制骨破壞和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的生物學(xué)功能。 7． 明確 RA 相關(guān) 小 分子在 RA 患者外周血各免疫細(xì)胞亞群中的功能。 18． 在細(xì)胞水平上，研究 IL17RC 可溶性多肽抑制 RANKL 及炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的生物學(xué)功能。 10． 研究特定亞群 Treg，對(duì) CIA 模型的關(guān)節(jié)炎形成、體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生及組織病理改變的作用。 3． 研究早期 RA 患者的主要 T 淋巴細(xì)胞。 7． 爭(zhēng)取篩選出新的 RA 關(guān)聯(lián)基因；精確定位多個(gè) RA 關(guān)聯(lián)基因。 19． 構(gòu)建原核表達(dá) RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽。 12． 從細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞因子分泌等方面，探討 MCSs 對(duì)淋巴細(xì)胞的分化的影響。 4． 分析早期 RA 患者滑膜組織與外周血中自身反應(yīng)性 TCRV 亞家族的表達(dá)。 3. RA 相關(guān)新型炎癥靶點(diǎn)及其干預(yù)策略研究 1） 針對(duì)靶分子的序列特異性 siRNA 的設(shè)計(jì)和篩選。 2） RA 特征性 SNP 的分布研究。 2）上述 RA 相關(guān)小分子調(diào)控免疫功能的機(jī)制研究。 2） Wnt/DKK1 通路在 RA 滑膜細(xì)胞活化中的作用研究。 3) 分離純 化 Vγ1 和 Vγ4 γδ T 細(xì)胞，在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至關(guān)節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 經(jīng)費(fèi)比例： 15% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院北京基因組研究所、中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 課題負(fù)責(zé)人： 陳唯軍 學(xué)術(shù)骨干： 楊光、牟峰、張明誠、董潔、孫宏賀、 趙永岐 課題 RA 的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 預(yù)期目標(biāo)： 通過系統(tǒng)研究 RA 患者自身抗原特異性 T 細(xì)胞表位和 T 細(xì)胞表面分子調(diào)控自身免疫應(yīng)答的方式，以及不同 T 細(xì) 胞亞群的調(diào)控機(jī)制，深入認(rèn)識(shí) RA 自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞活化的致病機(jī)制，最終形成擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的免疫相關(guān)疾病診斷和治療的新產(chǎn)品，提供治療或者控制嚴(yán)重影響我國人民身體健康的自身免疫病的新策略。 14 4）新的自身抗原在 HLADR4 遺傳背景下誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究。課題一至五，共同為課題六提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而課題六是在其他課題研究的基礎(chǔ)上，研究成果服務(wù)于 RA 治療的必要途徑，為課題一至五提供臨床落腳點(diǎn)。從 RA 發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)，在RA 發(fā)生的遺傳背景、免疫機(jī)制以及臨床診斷和干預(yù)方法等多方面，展開系統(tǒng)的研究工作。 4. 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)： 1）所在實(shí)驗(yàn)室既有教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、教育部臨床免疫重點(diǎn)學(xué)科，又有衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 211 重點(diǎn)學(xué)科，實(shí)驗(yàn)室裝備先進(jìn)，技術(shù)力量雄厚，保證了實(shí)驗(yàn)需要的所有技術(shù)平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)在國內(nèi)處于領(lǐng)先水平。在上述 RA 發(fā)病的新的免疫學(xué)機(jī)制研究基礎(chǔ)上，我們將從 RA 發(fā)病的不同環(huán)節(jié)，充分把握本團(tuán)隊(duì)的創(chuàng)新性和突破性，對(duì) RA 早期診斷和免疫干預(yù)新策略 進(jìn)行深入研究。 13. 對(duì)有臨床應(yīng)用前景的研究結(jié)果申請(qǐng) 相關(guān) 專利。 5. 闡述抗原表位結(jié)構(gòu)、 T 細(xì)胞表面糖表位及其他表面分子對(duì)自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制 ，探討 其臨床應(yīng)用價(jià)值。 6. RA 干預(yù)新策略的研究 ： 本項(xiàng)目組成員既往圍繞上述 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量的原創(chuàng)性研究。 3. RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷機(jī)制 ：在前期原創(chuàng)性研究基礎(chǔ)上，從滑膜炎癥的啟動(dòng)、進(jìn)展及骨破壞等不同階段，在分子、細(xì)胞及一系列基因敲除動(dòng)物層面，利用抗體阻斷、 RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染等方法深入研究 Th17與滑膜細(xì) 胞的相互作用，系統(tǒng)闡述 Th17 細(xì)胞調(diào)控滑膜炎癥和骨破壞的分子通路，為發(fā)現(xiàn) RA 相關(guān)炎癥及免疫損傷的新機(jī)制，尋找 RA 新型治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。 2. RA的自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究 ：本 項(xiàng)目組長(zhǎng)期從事 RA自身免疫應(yīng)答機(jī)制研究，在成熟的免疫學(xué)研究平臺(tái)基礎(chǔ)上，對(duì)抗原特異性 T細(xì)胞的自身免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行深入研究，以項(xiàng)目組前期工作發(fā)現(xiàn)的新抗原為模型，系統(tǒng)探討抗原特異性 T細(xì)胞抗原表位誘導(dǎo)的 T細(xì)胞活化、新發(fā)現(xiàn)的 T細(xì)胞表面分子免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制等原創(chuàng)性研究，為 RA自身免疫應(yīng)答新機(jī)制研究提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。除了易感基因可做為診斷靶標(biāo)外，本研究團(tuán)隊(duì)前期工作發(fā)現(xiàn)的一系列血清蛋白或抗原，甚至小分子等均可做為新型診斷靶標(biāo)用于 RA 臨床，本項(xiàng)目將對(duì)上述新的血清蛋白標(biāo)志分子或抗原進(jìn)行大樣本研究，為其用于臨床診斷靶標(biāo)提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 4. 系統(tǒng)分析新發(fā)現(xiàn)的自身抗原特異性 T 細(xì)胞表型和功能特征。 5 12. 研究成果預(yù)期在國內(nèi)外風(fēng)濕病和免疫學(xué)專業(yè)期刊上發(fā)表一系列高水平論文，包括 SCI 收錄文章。而炎癥和骨破壞作為上游免疫反應(yīng)導(dǎo)致的直接致病效應(yīng)，在 RA 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，是發(fā)病機(jī)制上游環(huán)節(jié)致病作用的驗(yàn)證，也為新 的免疫干預(yù)策略提供最直接的證據(jù)，因此，對(duì) 炎癥和骨破壞啟動(dòng)及進(jìn)展過程的分子機(jī)制 研究十分重要。 3. 臨床特色： 本項(xiàng)目的實(shí)施需要大量臨床標(biāo)本，本項(xiàng)目具有豐富的臨床資源保證了項(xiàng)目的順利進(jìn)行，國際一流的臨床學(xué)者參與，保證了研究 方向和解決的關(guān)鍵問題切實(shí)符合臨床需要，臨床應(yīng)用具有可行性。 （五）課題相互關(guān)系及設(shè)置： 各課題間相互關(guān) 系 本項(xiàng)目擬從 RA 發(fā)病機(jī)制各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵問題 出發(fā)，以本研究團(tuán)隊(duì)的大量前期工作為基礎(chǔ)，結(jié)合國外最新研究進(jìn)展設(shè)置課題。課題五是對(duì)新發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因以及前四個(gè)課題中鑒定的新型生物標(biāo)志分子進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究，為這些 RA 特異性分子用于臨床診斷靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。 3）抗原肽在 HLADRB1 特異性 T 細(xì)胞激活中的作用。 3) 糖芯片檢測(cè)。 2) γδT 細(xì)胞二個(gè)主要亞群在 CIA 的作用：應(yīng)用抗 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對(duì)相應(yīng)的 Vγ1 和 Vγ4 T 細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或 Vγ4 γδT 細(xì)胞對(duì)關(guān)節(jié)炎的影響。 2. RA 滑膜細(xì)胞活化的新的分子調(diào)控機(jī)制研究 1） Cyr61 在 RA 滑膜細(xì)胞活化中的作用研究。 RA 免疫調(diào)控機(jī)制中的作用