【正文】 疫調(diào)控機制進行系統(tǒng)深入的研究，為 RA 免疫干預策略提供新的靶向。 經(jīng)費比例： 20% 承擔單位： 北京大學、南開大學 課題負責人： 栗占國 學術骨干： 尹芝南、穆榮、洪章勇、何菁、葉華 課題 RA 易感基因及早期診斷靶標研究 預期目標： 鑒定 RA 新的易感基因、 miRNA 表達譜及新的血清蛋白標志分子，尋找 RA新的生物靶標用于臨 床早期診斷。 研究內(nèi)容： 本課題將在項目組成員既往研究以及本項目前述研究基礎之上，針對 RA 自身免疫反應的啟動、調(diào)控、炎癥反應及骨破壞等四個關鍵環(huán)節(jié)，探索 RA 干預的新策略，并通過與傳統(tǒng)緩解病變抗風濕藥（ DMARDs）甲氨蝶呤比較，評價新型免疫治療策略的療效及安全性。 4. 新型生物制劑對 RA 骨破壞的抑制作用研究 1） OPGHSP 重組蛋白對 RA 骨損傷和滑膜炎癥的抑制作用研究。 6． T 細胞二個亞群（ Vγ1/Vγ4）產(chǎn)生 IFNγ 和 IL4 的分子機制研究。 14． 對項目組前期發(fā)現(xiàn)的 RA 關聯(lián) SNP 進行進一步基因定位工作，并在大樣本中驗證。 21 （二）預期目標 1． 爭取 獲得多個 RA 相關的新的候選抗原和表位。 9． 完成 ClassI， ClassIIa， ClassIIb 和 ClassIV 的代表性 HDAC 同功酶的同源模建和結(jié)構(gòu)優(yōu)化工作。 4． 糖表位特異性抗體和抗 T 細胞抗體作用于 RAT 細胞后導致其表型和功能變化的體外實驗。 12． 上調(diào)或下調(diào) RA 相關小 分子的表達，分析其對各種免疫細胞活化及分化功能的影響。 （二）預期目標 1． 爭取獲得多個 RA 自身抗原。 9． 確定豆蔻酸化變構(gòu)肽的免疫學功能。 第三年度 （一）研究內(nèi)容 1． 檢測 RA 自身抗原的修飾特點。 9． 利用從 IL10/Foxp3 Tg 小鼠獲得的不同亞群 Treg細胞，探討不同亞型 Treg對 CIA 動物模型的治療作用。 17． 利用 siRNA 檢測下調(diào) RA 相關炎癥新靶點對 RA 細胞炎性反應及自身抗原的免疫反應的作用。 4． 成功鑒定 RAT 細胞膜表面葡聚糖基化修飾的膜翻轉(zhuǎn)異位抗原。 13． 明確不同亞群 Treg 細胞對初次和再次免疫應答的調(diào)控作用研究，及在此作用中小分子化合物對免疫反應的干預作用。 3. 合成并純化目標表位肽，體外刺激分析其對 T/B 細胞功能的影響。 11. 分析 Cyr6 Wnt/DKK1 途徑對于成骨細胞和破骨細 胞的成長、細胞侵蝕能力、細胞移行能力的影響。 18. 探討使用 RA 相關炎癥新靶點 siRNA 治療的 CIA 小鼠的病理變化、免疫反應特點。 5. 了解 RAT 細胞表面膜翻轉(zhuǎn)異位抗原誘導調(diào)節(jié)性抗體產(chǎn)生的機制，提出新假說。 27 14. 了解 RA 相關炎癥新靶點特異性 siRNA 對 CIA 小鼠的治療效果；闡明其發(fā)揮作用的免疫學機理。 4. 利用 IL6/IL8 基因敲除小鼠，觀察 Th17 及其炎癥因子、 Cyr61 和 Wnt/DKK1對 CIA 模型的影響。 13. 人源化 RANKL TNF 樣區(qū)單克隆抗體對 RA 模型保護性作用及其機制的研究。 8. 力爭獲得低免疫原性、高親和力的 Cyr61 人源化抗體，為 RA 的免疫干預提供新干預靶點和手段，并為進入中試生產(chǎn)工藝和臨床研究申報奠定基礎。 3. 建立和完善系統(tǒng)生物醫(yī)學相關技術平臺和技術體系，研究和開發(fā)有自主知識產(chǎn)權(quán)的系統(tǒng)生物醫(yī)學和轉(zhuǎn)化醫(yī)學相關新技術、新模型和新理論。另外 CML 治療雖然有一定進展，如針對 BCRAbl 融合蛋白的 伊馬替尼 (imatinib)有一定效果，但逐漸發(fā)現(xiàn)有耐藥發(fā)生，因此必須發(fā)展其他治療方案，前期研究 基于系統(tǒng)生物醫(yī)學理論設計新型治療方案， 顯示伊馬替尼 (imatinib)和硫化砷（ arsenic sulfide）合用具有協(xié)同作用。 第三 年 1． 啟動白血病或腫瘤全 基因組 全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測和分析體系 。根除幽門螺桿菌感染能明顯降低重度癌前病變及胃癌的發(fā)病風險。 5． 胃上皮細 胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的效應分子與調(diào)控機制 胃癌發(fā)生呈明顯的階段性變化，伴隨發(fā)生的分子事件眾多，除可用于診斷和預警的分子標志物外，本課題組以往的研究還提示存在一些關鍵的效應分子，對這些過程中的關鍵因素進行阻斷可逆轉(zhuǎn)胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化過程，明確這些關鍵因素有助于提出可用于干預的關鍵效應因子，達到早期治療的目的。 關鍵標志物的篩選炎性改變癌前病變早期胃癌進展轉(zhuǎn)移致病因素宿主因素異常分子表觀修飾惡性轉(zhuǎn)化惡性表型正常細胞 圖 2 胃癌發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)示意圖 本項目圍繞以上六個與胃癌發(fā)生密切相關的關鍵環(huán)節(jié)進行胃癌標志物的篩選 （見圖 2），具體科學問題是： 1．幽門螺桿菌致癌過程中的關鍵因子 41 幽門螺桿菌可導致胃癌風險增高已得到公認，但不同幽門螺桿菌菌株感染，給予宿主的刺激信號不同，導致其致病作用不同，但對何種菌株、那些基因在胃粘膜癌變過程中可引起惡性表型及其具體機制卻有待于明確，同時在此過程密切相關的幽門螺桿菌特異毒素蛋白的功能及相關機制也有待闡明，這對闡明幽門螺桿菌相關性胃癌遺傳標志，對于胃癌高風險個體預警以及幽門螺桿菌有效干預具有重要意義。 第二 年 1． 進一步 完善系統(tǒng)生物醫(yī)學研究技術平臺體系：尤其 全 基因組 外顯子突變檢測和分析技術；完善 表觀遺傳組等 技術體系； 初步建立全基因?qū)用娴幕蚪M結(jié)構(gòu)異常檢測和分析技術體系 。 AMLM2b 型白血病是更為常見的疾病，盡管基礎研究已經(jīng)獲得很大進展，但臨床上 還停留在聯(lián)合化療階段，近年來雖然治療緩解率較高，但復發(fā)、死亡率仍然居高不下，預后較差。 （二）五年預期目標 : 1. 構(gòu)建白血病 APL 和 AMLM2b 以及 CML 亞型發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中動態(tài)生物分子相互作用網(wǎng)絡和調(diào)控網(wǎng)絡模型，并建立 1種以上白血病亞型的數(shù)學模型。 6. 了解 RA 相關炎癥新靶點在 RA 自身免疫發(fā)生中的調(diào)控作用。 11. 評價雙靶向 HDACi 分子治療 RA 的效果。其免疫原性與靶蛋白比較。 11. 阻斷自身免疫反應的激活治療 RA 的實驗研究 12. 了解變構(gòu)肽治療對 CIA 小鼠模型的免疫系統(tǒng)的影響，了解其發(fā)揮作用的免疫學機理。 3. 明確 T 細胞表位特異性應答與疾病相關性。 16. 娃兒藤堿類似物 對 CIA 鼠關節(jié)炎的抑制作用研究 ， 研究小分子化合物在關節(jié)炎預防和治療中作用。 9. 研究 IL17 與 Cyr61 表達對于成骨細胞和破骨細胞的形成與功能的作用。 第四年度 （一）研究內(nèi)容 1. 鑒定與 RA 相關的新型自身抗原在 RA 發(fā)病過程中的免疫學特性和功能。 11． 力爭篩選出多個 RA 關聯(lián)基因和 CNP，闡明其致病機制。 2． 系統(tǒng)分析其 TCR 特異性、表達水平以及 ZAP70 等信號途徑改變。 15． 檢測小分子化合物對 CII 免疫后不同階段 CIA 小鼠中 Treg 亞群數(shù)量，格局和功能的改變。 7． 采用小鼠軟骨細胞或成骨細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，研究阻斷 Cyr61 后對于成骨細胞生長與維持的影響。 15． 闡明 IL17RC 可溶性多肽抑制骨破壞和炎癥反應相關因子的生物學功能。 7． 明確 RA 相關 小 分子在 RA 患者外周血各免疫細胞亞群中的功能。 18． 在細胞水平上，研究 IL17RC 可溶性多肽抑制 RANKL 及炎性細胞因子產(chǎn)生的生物學功能。 10． 研究特定亞群 Treg，對 CIA 模型的關節(jié)炎形成、體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生及組織病理改變的作用。 3． 研究早期 RA 患者的主要 T 淋巴細胞。 7． 爭取篩選出新的 RA 關聯(lián)基因；精確定位多個 RA 關聯(lián)基因。 19． 構(gòu)建原核表達 RANKL TNF 樣區(qū)多肽疫苗、 IL17RC 可溶性多肽。 12． 從細胞增殖、分化、細胞因子分泌等方面，探討 MCSs 對淋巴細胞的分化的影響。 4． 分析早期 RA 患者滑膜組織與外周血中自身反應性 TCRV 亞家族的表達。 3. RA 相關新型炎癥靶點及其干預策略研究 1） 針對靶分子的序列特異性 siRNA 的設計和篩選。 2） RA 特征性 SNP 的分布研究。 2）上述 RA 相關小分子調(diào)控免疫功能的機制研究。 2） Wnt/DKK1 通路在 RA 滑膜細胞活化中的作用研究。 3) 分離純 化 Vγ1 和 Vγ4 γδ T 細胞，在體外擴增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至關節(jié)炎小鼠，觀察不同亞群 γδ T 細胞對關節(jié)炎的調(diào)節(jié)作用。 經(jīng)費比例： 15% 承擔單位： 中國科學院北京基因組研究所、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 課題負責人： 陳唯軍 學術骨干： 楊光、牟峰、張明誠、董潔、孫宏賀、 趙永岐 課題 RA 的自身免疫應答機制研究 預期目標： 通過系統(tǒng)研究 RA 患者自身抗原特異性 T 細胞表位和 T 細胞表面分子調(diào)控自身免疫應答的方式，以及不同 T 細 胞亞群的調(diào)控機制，深入認識 RA 自身反應性 T 細胞活化的致病機制，最終形成擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的免疫相關疾病診斷和治療的新產(chǎn)品，提供治療或者控制嚴重影響我國人民身體健康的自身免疫病的新策略。 14 4）新的自身抗原在 HLADR4 遺傳背景下誘發(fā)關節(jié)炎的實驗研究。課題一至五，共同為課題六提供理論基礎和實驗依據(jù)，而課題六是在其他課題研究的基礎上，研究成果服務于 RA 治療的必要途徑，為課題一至五提供臨床落腳點。從 RA 發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)，在RA 發(fā)生的遺傳背景、免疫機制以及臨床診斷和干預方法等多方面，展開系統(tǒng)的研究工作。 4. 實驗平臺： 1）所在實驗室既有教育部創(chuàng)新團隊、教育部臨床免疫重點學科，又有衛(wèi)生部重點實驗室、 211 重點學科，實驗室裝備先進，技術力量雄厚，保證了實驗需要的所有技術平臺，實驗技術在國內(nèi)處于領先水平。在上述 RA 發(fā)病的新的免疫學機制研究基礎上，我們將從 RA 發(fā)病的不同環(huán)節(jié)，充分把握本團隊的創(chuàng)新性和突破性，對 RA 早期診斷和免疫干預新策略 進行深入研究。 13. 對有臨床應用前景的研究結(jié)果申請 相關 專利。 5. 闡述抗原表位結(jié)構(gòu)、 T 細胞表面糖表位及其他表面分子對自身反應性 T 細胞應答的調(diào)控機制 ，探討 其臨床應用價值。 6. RA 干預新策略的研究 ： 本項目組成員既往圍繞上述 RA 發(fā)病的各環(huán)節(jié)進行了大量的原創(chuàng)性研究。 3. RA 相關炎癥及免疫損傷機制 ：在前期原創(chuàng)性研究基礎上，從滑膜炎癥的啟動、進展及骨破壞等不同階段，在分子、細胞及一系列基因敲除動物層面，利用抗體阻斷、 RNA干擾和基因轉(zhuǎn)染等方法深入研究 Th17與滑膜細 胞的相互作用，系統(tǒng)闡述 Th17 細胞調(diào)控滑膜炎癥和骨破壞的分子通路，為發(fā)現(xiàn) RA 相關炎癥及免疫損傷的新機制，尋找 RA 新型治療靶點提供依據(jù)。 2. RA的自身免疫應答機制研究 ：本 項目組長期從事 RA自身免疫應答機制研究，在成熟的免疫學研究平臺基礎上，對抗原特異性 T細胞的自身免疫應答機制進行深入研究，以項目組前期工作發(fā)現(xiàn)的新抗原為模型，系統(tǒng)探討抗原特異性 T細胞抗原表位誘導的 T細胞活化、新發(fā)現(xiàn)的 T細胞表面分子免疫應答調(diào)控機制等原創(chuàng)性研究，為 RA自身免疫應答新機制研究提供重要實驗依據(jù)。除了易感基因可做為診斷靶標外，本研究團隊前期工作發(fā)現(xiàn)的一系列血清蛋白或抗原，甚至小分子等均可做為新型診斷靶標用于 RA 臨床，本項目將對上述新的血清蛋白標志分子或抗原進行大樣本研究，為其用于臨床診斷靶標提供重要實驗依據(jù)。 4. 系統(tǒng)分析新發(fā)現(xiàn)的自身抗原特異性 T 細胞表型和功能特征。 5 12. 研究成果預期在國內(nèi)外風濕病和免疫學專業(yè)期刊上發(fā)表一系列高水平論文，包括 SCI 收錄文章。而炎癥和骨破壞作為上游免疫反應導致的直接致病效應，在 RA 發(fā)病機制中具有重要作用，是發(fā)病機制上游環(huán)節(jié)致病作用的驗證，也為新 的免疫干預策略提供最直接的證據(jù)，因此，對 炎癥和骨破壞啟動及進展過程的分子機制 研究十分重要。 3. 臨床特色： 本項目的實施需要大量臨床標本，本項目具有豐富的臨床資源保證了項目的順利進行，國際一流的臨床學者參與，保證了研究 方向和解決的關鍵問題切實符合臨床需要，臨床應用具有可行性。 （五）課題相互關系及設置： 各課題間相互關 系 本項目擬從 RA 發(fā)病機制各環(huán)節(jié)的關鍵問題 出發(fā)，以本研究團隊的大量前期工作為基礎，結(jié)合國外最新研究進展設置課題。課題五是對新發(fā)現(xiàn)的 RA 易感基因以及前四個課題中鑒定的新型生物標志分子進行臨床轉(zhuǎn)化研究，為這些 RA 特異性分子用于臨床診斷靶標奠定基礎。 3）抗原肽在 HLADRB1 特異性 T 細胞激活中的作用。 3) 糖芯片檢測。 2) γδT 細胞二個主要亞群在 CIA 的作用：應用抗 Vγ1 或 Vγ4 特異性抗體對相應的 Vγ1 和 Vγ4 T 細胞進行體內(nèi)清除，觀察 Vγ1 或 Vγ4 γδT 細胞對關節(jié)炎的影響。 2. RA 滑膜細胞活化的新的分子調(diào)控機制研究 1） Cyr61 在 RA 滑膜細胞活化中的作用研究。 RA 免疫調(diào)控機制中的作用