13基因工程的操作過(guò)程2-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 AAG 539。 539。 G CTTAA AATTC G 539。 G CTTAA 539。 G CCTAG GATCC G 539。 539。 539。 GGATCG CCTAGC 539。 539。 539。 539。 C 退火 Pst I Pst I C 339。 539。 G T4DNA ligase TdT TdT dTTP dATP GTTTTTTTTTT 339。 539。 GGATC CCTAG 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 539。 G AATTC CTTAAG OH HO OH HO 堿性磷酸單酯酶 堿性磷酸單酯酶 重組率 （ 2）提高重組率的方法 加裝同聚尾末端： CTGCA 339。 CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 339。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無(wú)水無(wú)去污劑 細(xì)菌原生質(zhì)體 的制備： 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 取 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（ 108109個(gè)原生質(zhì)體），加入 10 20 ml DNA重組連接液，同時(shí)加入含有 PEG1000和 Ca2+的等滲溶液，混勻 細(xì)菌原生質(zhì)體 的轉(zhuǎn)化： 細(xì)菌原生質(zhì)體 的再生 ： 原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。 ori Ap + Xgal 重組子（ Apr + lacZ） 將外源基因克隆在 pUC18的 lacZ’標(biāo)記 基因內(nèi)部 ， 使之滅活 ， 此時(shí)重組子呈 Apr、 lacZ， 淡黃色菌落；而非重組子則呈 Apr、 lacZ+， 藍(lán)色菌落 （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 限制性酶切圖譜法 所謂的 限制性酶切圖譜法 就是對(duì)載體上插入的外源 DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分 重組子 與非重組子，而且還能鑒定目的重組子 。 539。 據(jù)此 ， 只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素 ， 理論上長(zhǎng)出的菌落即是含有目的基因的目的重組子 在實(shí)際操作過(guò)程中 ， 由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性 ， 因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒 ， 二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 。將 待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的目的重組子可 其表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性 的多糖或單糖。其中， DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) （二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落原位雜交法的基本操作： 影印 用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板 洗滌 雜交 感光 用 NaOH溶液浸泡影印薄膜 用 SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃ 烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫 用 SSCSDS液洗滌雜交薄膜 用 X光膠片覆蓋薄膜感光 （二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 1）雜交探針的制備： 用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件： 單鏈結(jié)構(gòu) （ 雙鏈 DNA可用堿變性 ） 足夠長(zhǎng)度 （ 至少 12個(gè) 堿基 ） 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 探針的制備方法或來(lái)源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTA AAGCGGATCG TAGGTCGACCTACTGGATA AG CTGGGC A（二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記： 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4PNP Mg2+ pppATP（ g32PATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ (二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記 ： 介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC 一 微克 pUC18共有 分子 （ / 2686X660） ， 也就是說(shuō) ， 每 3400個(gè) pUC18分子才有 一 個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞 另一方面 ， 在實(shí)際操作過(guò)程中 ， 轉(zhuǎn)化 一 微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細(xì)胞 ， 大約含有 2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞 ， 也就是說(shuō) ， 每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納 pUC18 DNA 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 2）轉(zhuǎn)化率的用途 利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì) DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模 例如， 某一 DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為 20%，轉(zhuǎn)化率為 107/mg載體， 經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低 100倍，欲獲得 104個(gè) 重組克隆，需投入多少載體 DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？ 若重組率為 100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生 104個(gè)重組克隆需要： 104 / 107 X 10 2 = mg 載體 DNA 考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為 20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： / 20% = mg 載體 DNA 載體投入量確定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶ 1的要求算 出（ 5 mg），甚至 還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 a. 載體及 DNA重組分子方面： 載體本身的性質(zhì)： 不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí) 插入片段的大?。? 對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 b. 受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如： pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌 ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 ： 受體細(xì)胞的預(yù)處理： 影響最大 供受體的比例： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ml 感受態(tài) 細(xì)胞 50 ng DNA 轉(zhuǎn)化方法 ： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106
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