13基因工程的操作過程2(文件)
【正文】 ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗藥性篩選法可區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子、重組子 與 非重組子 將外源 DNA片段插在 EcoRI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcr 將外源 DNA片段插在 BamHI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、 Tcr 重組子呈 Apr、 Tcs （ 2）抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉(zhuǎn)化液涂布含有 Ap的平板 再將 Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至 含有 Ap和 Tc的平板上 在 Ap平板上生長(zhǎng)、但在 Ap和 Tc平板上 不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為 重組子 Ap Ap + Tc 影印 挑選 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法 （ 1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理： 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與 非轉(zhuǎn)化子 ，一般不能區(qū)分 重組子 與 非重組子 。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。CTTGACTAAATCCGA DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記： 介導(dǎo)的缺刻前移標(biāo)記 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a32PdATP） 5‘ … GCTC AGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ DNase I DNA pol I （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： d. ABC熒光標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 熒光胺 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記 ： e. ABC顯色酶標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 顯色酶 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 生色底物 顏色產(chǎn)物 （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： f. 地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 dUTP連接臂 甾醇半抗原 digoxigenin DIG 抗體 顯色酶 交聯(lián)復(fù)合物 （二）克隆 DNA序列檢測(cè) DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本原理： DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段 ， 目前國(guó)際上流行采用 Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)定 DNA序列 ， 其工作原理是在 DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中 ， 通過位點(diǎn)特異性終止測(cè)定 DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有： DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ ddNTP） 聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp） 電腦自動(dòng)檢測(cè)、記錄、編輯程序 用于 DNA測(cè)序的專一性試劑盒（ Kit） （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本反應(yīng)： Klenow OH 339。 P A G T C GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA （三） 外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法 （ 1）淀粉酶目的基因的鑒定： 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。因此，目的重組子菌落周圍會(huì)形成透明圈。 如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落 ， 即可認(rèn)為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生 （三）外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法 （ 2）抗菌素抗性基因的鑒定： 目的重組子 誘導(dǎo)抗性 抽取重組質(zhì)粒 再次轉(zhuǎn)化 （三） 外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法 （ 3） DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定： 影印 用聚乙烯薄膜影印裂解平板 洗滌 雜交 感光 輕輕漂洗影印薄膜 ， 干燥固定 80℃ 烘干固定影印薄膜 與探針溶液中雜交 洗滌 、 干燥 、 感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板 聚乙烯膜 探針選用能與 目標(biāo)蛋白特異 性結(jié)合的 DNA 片段 （三） 外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法 （ 4）雜交釋放轉(zhuǎn)譯 鑒定： 合并 變性 掛柱 制備 上樣 淋洗 洗 脫 翻 譯 測(cè) 活 重組 DNA 單鏈 DNA mRNA 雜交的 mDNA 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 無(wú)細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng) ：麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物 （三）外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法 （ 1）放射免疫原位雜交 鑒定： 影印 用固定了特異性抗體的 聚乙烯薄膜 影印 洗滌 與 I125標(biāo)記的 IgG保溫 感光 輕輕漂洗影印薄膜 ， 干燥固定 與 I125標(biāo)記的 IgG保溫 洗滌 、 干燥 、 感光 用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌體噴灑 克隆平板 含抗體的聚乙烯膜 裂解平板 （三）外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法 （ 2）免疫沉淀 鑒定： 在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體 然后涂布轉(zhuǎn)化液 37℃ 培養(yǎng) 經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落變會(huì)分泌出目標(biāo) 蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑 此法簡(jiǎn)便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大 （三） 外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測(cè)定生物活性，又無(wú)現(xiàn)成的抗體使用，則可采
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