13基因工程的操作過程2(參考版)
2025-01-16 04:26本頁面
【正文】 如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落 ， 即可認(rèn)為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 2）抗菌素抗性基因的鑒定： 目的重組子 誘導(dǎo)抗性 抽取重組質(zhì)粒 再次轉(zhuǎn)化 （三） 外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 3） DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定： 影印 用聚乙烯薄膜影印裂解平板 洗滌 雜交 感光 輕輕漂洗影印薄膜 ， 干燥固定 80℃ 烘干固定影印薄膜 與探針溶液中雜交 洗滌 、 干燥 、 感光 用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板 聚乙烯膜 探針選用能與 目標(biāo)蛋白特異 性結(jié)合的 DNA 片段 （三） 外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 4）雜交釋放轉(zhuǎn)譯 鑒定： 合并 變性 掛柱 制備 上樣 淋洗 洗 脫 翻 譯 測 活 重組 DNA 單鏈 DNA mRNA 雜交的 mDNA 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 無細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng) ：麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法 （ 1）放射免疫原位雜交 鑒定： 影印 用固定了特異性抗體的 聚乙烯薄膜 影印 洗滌 與 I125標(biāo)記的 IgG保溫 感光 輕輕漂洗影印薄膜 ， 干燥固定 與 I125標(biāo)記的 IgG保溫 洗滌 、 干燥 、 感光 用 氯仿蒸汽 或 烈性噬菌體噴灑 克隆平板 含抗體的聚乙烯膜 裂解平板 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法 （ 2）免疫沉淀 鑒定： 在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體 然后涂布轉(zhuǎn)化液 37℃ 培養(yǎng) 經(jīng)培養(yǎng)后，目的重組子菌落變會分泌出目標(biāo) 蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑 此法簡便快速，但靈敏度低，抗體消耗量大 （三） 外源基因產(chǎn)物檢測 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可采用 聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行粗略的篩選 演講完畢，謝謝觀看！ 。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進(jìn)行鑒定 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 2）抗菌素抗性基因的鑒定： 抗菌素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性 。因此，目的重組子菌落周圍會形成透明圈。將難溶于水 的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。 P A G T C GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA （三） 外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 1）淀粉酶目的基因的鑒定： 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。 P T dNTP + ddATP T T T T T OH 339。CTTGACTAAATCCGA DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記： 介導(dǎo)的缺刻前移標(biāo)記 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a32PdATP） 5‘ … GCTC AGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ DNase I DNA pol I （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： d. ABC熒光標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 熒光胺 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記 ： e. ABC顯色酶標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 顯色酶 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 生色底物 顏色產(chǎn)物 （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： f. 地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 dUTP連接臂 甾醇半抗原 digoxigenin DIG 抗體 顯色酶 交聯(lián)復(fù)合物 （二）克隆 DNA序列檢測 DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測序法的基本原理： DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段 ， 目前國際上流行采用 Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定 DNA序列 ， 其工作原理是在 DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中 ， 通過位點(diǎn)特異性終止測定 DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有： DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ ddNTP） 聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp） 電腦自動檢測、記錄、編輯程序 用于 DNA測序的專一性試劑盒（ Kit） （二） 克隆 DNA序列檢測 DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測序法的基本反應(yīng)： Klenow OH 339。GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（ a32PdATP） 5’TTTTTTTTTTT 5’mRNA 3’cDNA 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC用 HindIII和 EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達(dá)到目的，但這兩種酶的價(jià)格只及 SphI的 1 / 50 限制性酶切圖譜法 全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 用 EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb 用 PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 目的重組子
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