【正文】 將難溶 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 用 BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 電泳觀察酶解產(chǎn)物片段 重組子： kb + kb 非重組子： kb 如果外源 DNA片段也是 kb， 最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然 后通過其長度來鑒定其是否為重組子 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 如果外源 DNA片段插在 pUC18的SphI位點處，原則上也可用 SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟，因為 SphI非常昂貴（每 100單位50美元）。 GGGGGGACGTC 539。 p 539。 539。 539。 G G 339。 G CCTAG GATCC G 539。 G CCTAG GATCC G 539。 T ACTAG 539。 G CTTAA 539。 AATTC G G CTTAA AATTC G 539。 GATCA T T4DNA ligase TGATCC ACTAGG 539。 539。 AATTC G T4DNA ligase 539。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 C 339。 539。 GAATTC CTTAA G 539。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在 %的蔗糖等滲溶液中。GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（ a32PdATP） 5’TTTTTTTTTTT 5’mRNA 3’cDNA 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進行鑒定 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 2）抗菌素抗性基因的鑒定： 抗菌素抗性基因表達的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性 。CTTGACTAAATCCGA DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記： 介導(dǎo)的缺刻前移標(biāo)記 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a32PdATP） 5‘ … GCTC AGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ DNase I DNA pol I （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： d. ABC熒光標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 熒光胺 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記 ： e. ABC顯色酶標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 顯色酶 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 生色底物 顏色產(chǎn)物 （二） 克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： f. 地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 dUTP連接臂 甾醇半抗原 digoxigenin DIG 抗體 顯色酶 交聯(lián)復(fù)合物 （二）克隆 DNA序列檢測 DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測序法的基本原理： DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段 ， 目前國際上流行采用 Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定 DNA序列 ， 其工作原理是在 DNA聚合反應(yīng)的進程中 ， 通過位點特異性終止測定 DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有： DNA鏈聚合反應(yīng)時的定點隨機中斷（ ddNTP） 聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp） 電腦自動檢測、記錄、編輯程序 用于 DNA測序的專一性試劑盒（ Kit） （二） 克隆 DNA序列檢測 DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測序法的基本反應(yīng)： Klenow OH 339。在實驗時，擴增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的 37℃ 培養(yǎng)一個小時 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴增操作 3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴增 （ 2）擴增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序 擴增和表達載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選 表達外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測 （二）克隆 DNA序列檢測 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過程 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉(zhuǎn)化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 b