【正文】 將難溶 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 用 BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 電泳觀察酶解產(chǎn)物片段 重組子： kb + kb 非重組子： kb 如果外源 DNA片段也是 kb， 最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然 后通過(guò)其長(zhǎng)度來(lái)鑒定其是否為重組子 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 如果外源 DNA片段插在 pUC18的SphI位點(diǎn)處，原則上也可用 SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)?SphI非常昂貴（每 100單位50美元）。 GGGGGGACGTC 539。 p 539。 539。 539。 G G 339。 G CCTAG GATCC G 539。 G CCTAG GATCC G 539。 T ACTAG 539。 G CTTAA 539。 AATTC G G CTTAA AATTC G 539。 GATCA T T4DNA ligase TGATCC ACTAGG 539。 539。 AATTC G T4DNA ligase 539。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 C 339。 539。 GAATTC CTTAA G 539。在制備過(guò)程中，菌體應(yīng)始終懸浮在 %的蔗糖等滲溶液中。GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（ a32PdATP） 5’TTTTTTTTTTT 5’mRNA 3’cDNA 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類(lèi)似的方法進(jìn)行鑒定 （三）外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法 （ 2）抗菌素抗性基因的鑒定： 抗菌素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗生素的抗性 。CTTGACTAAATCCGA DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記： 介導(dǎo)的缺刻前移標(biāo)記 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（ a32PdATP） 5‘ … GCTC AGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ 5‘ … GCTCAGCTGGAGT… 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTCA… 5‘ DNase I DNA pol I （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： d. ABC熒光標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 熒光胺 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記 ： e. ABC顯色酶標(biāo)記 GCTTGAGCAGTAACCTG 顯色酶 Biotin 生物素 Avidin 生物素結(jié)合蛋白 烷烴連接臂 生色底物 顏色產(chǎn)物 （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 (2)雜交探針的標(biāo)記： f. 地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 dUTP連接臂 甾醇半抗原 digoxigenin DIG 抗體 顯色酶 交聯(lián)復(fù)合物 （二）克隆 DNA序列檢測(cè) DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本原理： DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段 ， 目前國(guó)際上流行采用 Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)定 DNA序列 ， 其工作原理是在 DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中 ， 通過(guò)位點(diǎn)特異性終止測(cè)定 DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有： DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ ddNTP） 聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（ 600 bp / 601 bp） 電腦自動(dòng)檢測(cè)、記錄、編輯程序 用于 DNA測(cè)序的專(zhuān)一性試劑盒（ Kit） （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) DNA序列分析法 雙脫氧末端終止測(cè)序法的基本反應(yīng)： Klenow OH 339。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的 37℃ 培養(yǎng)一個(gè)小時(shí) 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過(guò)程 l噬菌體轉(zhuǎn)染后的 30℃ 培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作 3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 （ 2）擴(kuò)增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序 擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選 表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過(guò)程 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) （二）克隆 DNA序列檢測(cè) （三）外源基因產(chǎn)物檢測(cè) 三、 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢） 第十三章 基因工程的操作過(guò)程 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、 目的重組子 與非目的重組子 轉(zhuǎn)化子 重組子 目的重組子 （一） 載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) 抗藥性篩選法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r （ 1）抗藥性篩選法的基本原理： pBR322 4363 b