13基因工程的操作過程2-免費閱讀
【正文】 如果透 明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍色本底， 易于辨認。 539。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子 （ 2）常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記： 哺乳動物細胞中存在兩條 dTTP的合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+ 用于高等 哺乳動物 細胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因 tk， 相應(yīng)的受體細胞則選擇 tk缺陷型 dCDP dTDP dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測 顯色篩選法 （ 1）顯色篩選法的基本原理： 顯色篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分 重組子與非重組子。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow 二、 重組 DNA分子 的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)與增） 第十三章 基因工程的操作過程 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化細胞的擴增 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化 Ca2+誘導(dǎo)的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等）， 1970年建立此技術(shù)，其原理是 Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做 感受態(tài) 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細胞 的制備： 100 ml 菌體培養(yǎng)至 OD600 = ， 離心收集菌體 用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心 用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置 12 24小時，備用 收集菌體 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細胞 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 取 100 ml 感受態(tài)細胞，加入相當(dāng)于 50 ng 載體的重組 冰浴放置半小時 在 42℃ 保溫 2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置 1 2分鐘 DNA連接液，混勻 加入 1 ml 新鮮培養(yǎng)基， 于 37℃ 培養(yǎng) 1 小時（擴增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源 DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質(zhì)體（細胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟M DNA分子 酵母菌、霉菌、植物細胞 也可用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化 （ 2）細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 不同細菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 HO 退火 539。 6. 重組率 （ 2）提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團： 539。 539。 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C 339。 C 539。 539。 C 339。 539。 539。 GGATC CCTAG GATCC 539。 T4DNA ligase CGATCC GCTAGG 539。 539。 T ACTAG 539。 539。 G CTTAA 539。 539。 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 539。 539。 BclI G CCTAG GATCC G 539。 539。 T4DNA pol 切平 539。 539。 CTAGG 539。 ACGTC 539。 GGGGGGACGTC 539。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow Pst I Sph I 平頭末端 C 339。 G G 339。 GGATCC CCTAGG T4DNA ligase Klenow 補平 GATCC 539。 GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG 539。 G CTTAA OH 539。 GCATG 339。 539。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體 DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納 DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長） 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 例如 ， pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108， 即每微克 pUC18中只有 108個分子能進入受體細胞 。用 HindIII和 EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及 SphI的 1 / 50 限制性酶切圖譜法 全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 用 EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb 用 PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E kb
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