【正文】 coRI 539。 539。 G CTTAA 539。 G CTTAA 539。 539。 539。 T ACTAG 539。 T ACTAG 539。 TGATCA ACTAGT 539。 539。 G CCTAG GATCC G 539。 T4DNA ligase CGATCC GCTAGG 539。 PstI 339。 GGATC CCTAG GATCC 539。 G CCTAG GATCC G 539。 539。 GGATC CCTAG GATCC 539。 539。 G G 339。 C 339。 G G 339。 539。 539。 C 539。 TTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAA 339。 GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 C 339。 539。 539。 539。 6. 重組率 （ 2）提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 539。 p 539。 HO 退火 539。 ACGTC 539。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 GGGGGGACGTC 539。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow 二、 重組 DNA分子 的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增） 第十三章 基因工程的操作過程 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等）， 1970年建立此技術(shù)，其原理是 Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做 感受態(tài) 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的制備： 100 ml 菌體培養(yǎng)至 OD600 = ， 離心收集菌體 用 10 ml 冰冷的 10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心 用 1 ml 冰冷的 75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 冰浴放置 12 24小時(shí)，備用 收集菌體 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 1） Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化： 取 100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于 50 ng 載體的重組 冰浴放置半小時(shí) 在 42℃ 保溫 2 分鐘（熱脈沖） 快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置 1 2分鐘 DNA連接液，混勻 加入 1 ml 新鮮培養(yǎng)基， 于 37℃ 培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增） 涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選 1. 轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù) （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源 DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組 DNA分子 酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞 也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化 （ 2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如 34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。 在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下 ， 細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙 ， 質(zhì)?；?DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn) 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子 （ 2）常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩條 dTTP的合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+ 用于高等 哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因 tk， 相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇 tk缺陷型 dCDP dTDP dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) 顯色篩選法 （ 1）顯色篩選法的基本原理： 顯色篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分 重組子與非重組子。 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 用 BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 電泳觀察酶解產(chǎn)物片段 重組子： kb + kb 非重組子： kb 如果外源 DNA片段也是 kb， 最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然 后通過其長度來鑒定其是否為重組子 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 如果外源 DNA片段插在 pUC18的SphI位點(diǎn)處，原則上也可用 SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)?SphI非常昂貴（每 100單位50美元）。GAACTGATTTAGGCT 5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG 539。將難溶 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。如果透 明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底， 易于