13基因工程的操作過程2-全文預覽
【正文】 用 聚丙烯酰胺凝膠電泳進行粗略的篩選 演講完畢，謝謝觀看！ 。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進行鑒定 （三）外源基因產(chǎn)物檢測 蛋白質(zhì)生物功能測定法 （ 2）抗菌素抗性基因的鑒定： 抗菌素抗性基因表達的蛋白質(zhì)能使受體細胞產(chǎn)生對該抗生素的抗性 。將難溶于水 的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。 P T dNTP + ddATP T T T T T OH 339。GAACTGATTTAGGCT 5’mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（ a32PdATP） 5’TTTTTTTTTTT 5’mRNA 3’cDNA 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC用 HindIII和 EcoRI聯(lián)合酶解同樣可以達到目的，但這兩種酶的價格只及 SphI的 1 / 50 限制性酶切圖譜法 全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 用 EcoRI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb 用 PstI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 目的重組子： kb + kb 或者： kb + kb pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E kb kb kb 區(qū)分目的重組子與非目的重組子 對圖示的克隆片段，轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA用 EcoRI酶切開后，只出現(xiàn) kb和 kb兩條帶子，實際上 kb的條帶中含有兩種不同的分子 kb kb E （二）克隆 DNA序列檢測 限制性酶切圖譜法 （ 2）部分酶解圖譜法： kb PstI EcoRI BamHI B B E kb kb E B 該重組質(zhì)粒經(jīng)酶解后，分別得到下列幾組數(shù)據(jù)： BamHI全酶解： kb BamHI+EcoRI全酶解： kb 其中 ， kb片段的存在表明該片段位于一端 BamHI部分酶解： kb 其中 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表 明兩者是連在一起的；同理 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者是連在一起的；最后 ， kb的片段必為 kb和 kb兩片段 ， 表明兩者 是連在一起的 （二）克隆 DNA序列檢測 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或 DNA片段的 同源序列 設(shè)計并合成 探針 ，以此搜尋篩選含有目的基因的 目的重組子 。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒 pUC18攜帶的 lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的 melC基因（黑色反應）等 （ 2）顯色篩選法的基本操作： pUC18 Ap r lacZ39。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體 DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納 DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長） 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 1）轉(zhuǎn)化率的定義 例如 ， pUC18對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108， 即每微克 pUC18中只有 108個分子能進入受體細胞 。在制備過程中，菌體應始終懸浮在 %的蔗糖等滲溶液中。 539。 C 退火 C 339。 GCATG 339。 GAATTC CTTAA G 539。 G CTTAA OH 539。 539。 GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG 539。 539。 GGATCC CCTAGG T4DNA ligase Klenow 補平 GATCC 539。 539。 G G 339。 C 339。 GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow Pst I Sph I 平頭末端 C 339。 GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 539。 GGGGGGACGTC 539。 GTACG T4DNA ligase TdT TdT dCTP dGTP GCATGCCCCCC 339。 ACGTC 539。 AATTC TTAAG TdT TdT dGTP dCTP GAATTGGGGGG CTTAA AATTC GGGGGGTTAAG GGATCCCCCCC CCTAG GATCC CCCCCCCTAGG GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 539。 CTAGG 539。 AATTC G T4DNA ligase 539。 539。 CTAGG CGATCC GCTAGG 539。 T4DNA pol 切平 539。 539。 539。 GGATCA CCTAGT 3. 不同粘性末端的連接 BamHI 539。 BclI G CCTAG GATCC G 539。 GATCA T T4DNA ligase TGATCC ACTAGG 539。 539。 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 539。 AATTC G G CTTAA AATTC G 539。 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG E
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