13基因工程的操作過(guò)程2-閱讀頁(yè)
2025-01-24 04:26本頁(yè)面
【正文】 載體投入量確定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶ 1的要求算 出（ 5 mg），甚至 還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 a. 載體及 DNA重組分子方面： 載體本身的性質(zhì)： 不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí) 插入片段的大小： 對(duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 b. 受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如： pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌 ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 2. 轉(zhuǎn)化率 （ 3）轉(zhuǎn)化率的影響因素 ： 受體細(xì)胞的預(yù)處理： 影響最大 供受體的比例： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ml 感受態(tài) 細(xì)胞 50 ng DNA 轉(zhuǎn)化方法 ： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個(gè) 原生質(zhì)體 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 105 106 / mg DNA lDNA轉(zhuǎn)染 107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化 106 109 / mg DNA 3. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 （ 1）擴(kuò)增操作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。其原理是：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子 （ 2）常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩條 dTTP的合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+ 用于高等 哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因 tk， 相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇 tk缺陷型 dCDP dTDP dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 （一）載體遺傳標(biāo)記檢測(cè) 顯色篩選法 （ 1）顯色篩選法的基本原理： 顯色篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分 重組子與非重組子。 ori Ap + Xgal 重組子（ Apr + lacZ） 將外源基因克隆在 pUC18的 lacZ’標(biāo)記 基因內(nèi)部 ， 使之滅活 ， 此時(shí)重組子呈 Apr、 lacZ， 淡黃色菌落；而非重組子則呈 Apr、 lacZ+， 藍(lán)色菌落 （二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 限制性酶切圖譜法 所謂的 限制性酶切圖譜法 就是對(duì)載體上插入的外源 DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分 重組子 與非重組子，而且還能鑒定目的重組子 。 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 用 BamHI酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒 DNA 電泳觀察酶解產(chǎn)物片段 重組子： kb + kb 非重組子： kb 如果外源 DNA片段也是 kb， 最好選用單一切口的酶將質(zhì)粒線型化，然 后通過(guò)其長(zhǎng)度來(lái)鑒定其是否為重組子 限制性酶切圖譜法 （ 1）全酶解圖譜法： pUC18 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P kb kb kb 區(qū)分重組子與非重組子 如果外源 DNA片段插在 pUC18的SphI位點(diǎn)處，原則上也可用 SphI酶解鑒定，但這樣做很不經(jīng)濟(jì)，因?yàn)?SphI非常昂貴（每 100單位50美元）。其中， DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) （二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 菌落原位雜交法的基本操作： 影印 用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板 洗滌 雜交 感光 用 NaOH溶液浸泡影印薄膜 用 SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 80℃ 烘干固定影印薄膜 薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫 用 SSCSDS液洗滌雜交薄膜 用 X光膠片覆蓋薄膜感光 （二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 1）雜交探針的制備： 用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件： 單鏈結(jié)構(gòu) （ 雙鏈 DNA可用堿變性 ） 足夠長(zhǎng)度 （ 至少 12個(gè) 堿基 ） 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 探針的制備方法或來(lái)源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTA AAGCGGATCG TAGGTCGACCTACTGGATA AG CTGGGC A（二）克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記： 5‘ HO 3‘ HO OH 3‘ OH 5‘ T4PNP Mg2+ pppATP（ g32PATP） 5‘ p 3‘ HO OH 3‘ p 5‘ (二） 克隆 DNA序列檢測(cè) 菌落噬菌斑原位雜交法 （ 2）雜交探針的標(biāo)記 ： 介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG 539。 539。將難溶 淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將 待鑒定的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的目的重組子可 其表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性 的多糖或單糖。如果透 明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底， 易于辨認(rèn)。 據(jù)此 ， 只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素 ， 理論上長(zhǎng)出的菌落即是含有目的基因的目的重組子 在實(shí)際操作過(guò)程中 ， 由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性 ， 因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒 ， 二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)
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