【正文】 種子罐 （ 27?C,40小時孢子發(fā)芽 ， 產(chǎn)生菌絲 ） → 二級種子罐（ 27?C,10~24小時 ， 菌體迅速繁殖 ， 粗壯菌絲體 ） → 發(fā)酵罐 ? 放線菌：生長更慢 ， 采用四級發(fā)酵 ? 酵母：比細菌慢 ， 比霉菌 ， 放線菌快 ，通常用一級種子 （ 二級發(fā)酵 ） 。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢， 主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。 ? 冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。Ru 嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶， 12小時最好。 產(chǎn)物生成量 ?在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。 菌種保藏的方法很多 ， 一般有下面幾種 ： A 斜面冰箱保藏法 （ 酵母 ） 斜面保藏是一種短期 、 過渡的保藏方法 ， 用新鮮斜面接種后 ， 置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子生長豐滿后 ， 放在 4℃ 冰箱保存 。 C間歇滅菌三次 ， 滅菌試驗合格后烘干備用 。這種保藏方法雖然需要一定的設(shè)備，要求亦比較嚴格，但由于該方法保藏效果好，對各種微生物都適用。 其保存期最長 。 這樣在細胞 接觸低溫前 ， 使細胞內(nèi)自由水通過膜滲出而不使其遇冷形成冰晶而傷害細胞 。 ?復(fù)壯措施： ? 對已衰退菌種配合一定培養(yǎng)條件進行單細胞分離純化 ? 淘汰衰退的個體 ? 選擇合適的培養(yǎng)基 思考題 名詞解釋 多因素低劑量的誘變效應(yīng)、互變異構(gòu)效應(yīng)、染色體畸變、基因突變、表型延遲、營養(yǎng)缺陷型、雜交育種、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生、菌種的擴培、接種量、菌種退化、菌種復(fù)壯 采集土壤微生物樣品時應(yīng)該注意哪些問題？ 什么是增殖培養(yǎng)？為什么要進行增殖培養(yǎng)？ 土壤中分離純化微生物的方法有哪些？請簡述之。 四、菌種的衰退與復(fù)壯 菌種衰退 菌種經(jīng)過長期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。用保護劑制備好菌液后，加入準備好的安瓶管中，一般安瓿管的裝量為－ 1mL。 E 液氮超低溫保藏法 （ 細菌 ， 真菌 ） 液氮超低溫保臧法足近幾年才發(fā)展起來的 ， 此法國外已較普遍采用 ， 是適用范圍最廣的微生物保藏法 。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異。適合于 產(chǎn)孢子或芽孢 的微生物。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“體眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 ? 菌種穩(wěn)定性的檢查 ? 無雜菌檢查 四、種子質(zhì)量標準 形態(tài) ?單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； ?霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng) 4天左右即于 4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏 7~8天菌體細胞開始自溶。 （ 2）濕度 制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。 ? 蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。 ? 種子罐級數(shù)取決于： ? 菌種生長特性（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； ? 所采用發(fā)酵罐的容積 ? 另外還與發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低 接種量（種子液體積 /培養(yǎng)液體積） 以及種子罐與發(fā)酵罐的容積比等有關(guān)。 放線菌孢子的制備 ? 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。 種子擴培的目的 ? 接種量的需要 ? 菌種的馴化 ? 縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平 種子的制備過程 ? 種子制備的過程大致可分為： ? 實驗室種子制備階段 ? 生產(chǎn)車間種子制備階段 一、實驗室種子的制備 ?實驗室種子的制備一般采用兩種方式 ? 對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以 采用固體培養(yǎng)基或斜面（靜置培養(yǎng)）培養(yǎng)孢子 ，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 原生質(zhì)體再生 原生質(zhì)體再生 就是使原生質(zhì)體重新長出細胞壁 ， 恢復(fù)完整的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)； 為獲得較高的再生率 ， 在實驗過程中應(yīng)避免剪切力過大使原生質(zhì)體破裂； 涂布時 ， 原生質(zhì)體濃度不宜過高； 菌齡 、 再生時的溫度 、 溶菌酶用量和溶壁時間等因素都會影響原生質(zhì)體的再生 。 這樣往往可以提高篩選效率 。 在再生成細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的 重組子 。 微生物 雜交育種 所使用的 配對菌株 稱為 直接親本 。 脫氨劑： 堿基脫氨或脫氮，引起堿基對轉(zhuǎn)換， 造成的遺傳損傷較多。 E 高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合 在誘變育種過程中高產(chǎn)菌株的獲得還必須有合適的 篩選條件的配合 。 C 劑量選擇 ? 各種 誘變因素 有它們各自的誘變劑量單位 ， 如紫外線劑量單位用焦耳 ， x一射線劑量單位是庫 （ 侖 ）每千克 ， 中子劑量單位是戈 。 ? 營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株中也可獲得抗反饋突變株。 經(jīng)誘變處理后 ， 微生物的遺傳物質(zhì) 、 DNA和 RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu) 發(fā)生改變 ， 從而引起微生物的 遺傳變異 。代謝更加旺盛 ,生產(chǎn)性能提高 。 據(jù)有的國家規(guī)定 ， 微生物中除啤酒酵母 、 脆壁酵母 、 黑曲霉 、 米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外 ， 其他微生物作為食用 ， 均需通過兩年以上的毒性試驗 。 2）搖瓶發(fā)酵篩選：將待測菌株進行液體振蕩培養(yǎng)，取 發(fā)酵濾液進行活力測定。 在這 —步 ， 增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用 ，而且控制得細一點 ， 好一點 。 ? 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標記 ， 記錄采樣時間 、 地點 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ，快速 、 準確地把所需要的菌種挑選出來 。 這些特性包括形態(tài) 、培養(yǎng)特征 、 營養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、 發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 ? 離地面 5~20cm處的土壤通氣良好、不受陽光直射，含菌量最高。 某些細菌的富集條件 富集對象 接種菌樣 添加營養(yǎng)物 (g) 特殊培養(yǎng)條件 好氧氨基酸氧化菌 土壤 – 好氧， 好氧性芽孢桿菌 土壤，