【正文】 所發(fā)生的那些突變 。 菌種的自然突變往往有兩種可能性 :菌種衰退 ,生產(chǎn)性能下降 。 誘變育種的基本原理 ? 誘變育種的 理論基礎(chǔ)是 基因突變 ， 所謂 突變 是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異 。 （ 1） 染色體畸變 是指染色體或 DNA片斷的 缺失、易位、逆位、重復(fù) 等。 ? 根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為 自然突變 和 誘發(fā)突變 。誘變因素 的種類很多 ， 有 物理的 、 化學(xué)的和生物的三大類 ， 見表 2－ 1。 誘變育種的一般步驟 出發(fā)菌株的選擇 ?自然界直接分離到的野生型菌株 ?經(jīng)歷過生產(chǎn)條件考驗的菌株 ?已經(jīng)歷多次育種處理的菌株 制備菌懸液 ? 待處理的菌懸液應(yīng)考慮微生物的生理狀態(tài)、懸液的均一性和環(huán)境條件； ? 盡可能選擇孢子或單倍體細(xì)胞作為誘變對象，避免表型延遲 。 誘變處理 ? 根據(jù)誘變劑用量對菌體致死率的曲線選擇合適的處理劑量。 突變菌株的篩選 （ 1）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 ? 生物合成途徑的某一步發(fā)生了酶缺陷，合成反應(yīng)不能完成，末端產(chǎn)物不能積累，因此末端產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用被解除。 ? 抗反饋突變株一般通過抗結(jié)構(gòu)類似物突變的方法篩選。 （ 3）組成型突變株的篩選 ? 分批限量加入誘導(dǎo)物法，解除菌株對誘導(dǎo)物的依賴 ? 交替培養(yǎng)法 （ 4）抗性突變株的篩選 ? 抗生素抗性突變 ? 抗噬菌體菌株的選育 ? 條件抗性突變 ? 敏感突變 誘變育種工作中幾個應(yīng)注意的問題 A 選擇好出發(fā)菌株 選好出發(fā)菌株對誘變效果有著極其重要的作用。如果用這種菌株于生產(chǎn)是很有益的，而用 作出發(fā)菌株則不適宜 。挑選出發(fā)菌株的標(biāo)準(zhǔn)是 產(chǎn)量高、 對誘變劑的敏感性大 、 變異幅度廣 ， 再確定誘變劑的使用及篩選條件 。 對 野生型菌株 單誘變因素有時也能取得好的效果 ， 但對老菌種單一誘變因素重復(fù)使用突變的效果不高 ， 這時可利用 復(fù)合因素 來擴大 誘變幅度 ， 提高 誘變效果 。 ? 化學(xué)誘變因素一般是以 溶液濃度 來計算劑量單位的 。 因此 可以用致死率作為選擇適宜劑量的依據(jù) 。 從經(jīng)誘變的大量個體中挑選優(yōu)良菌種不是一件容易的事 。 這樣 ， 可大大提高篩選的 工作效率 。 誘變與篩選 可以說是一個問題的兩個方面 ， 必須用辯證的觀點來看待 。 幾種常見的物理、化學(xué)誘變劑的使用方法 1）物理誘變劑：紫外線、 X— 射線、 γ— 射線，快中子； 電離輻射特點： 導(dǎo)致 DNA斷裂缺失，造成不可回復(fù) 的缺失突變。 紫外線是常用的誘變劑。 特點： 堿基類似物： 取代相應(yīng)堿基進(jìn)入 DNA鏈，具有 很高的特異性，但回復(fù)突變率高，很少使用。應(yīng)用的范圍較廣， 嵌入劑： 引起移碼突變。 5BU 酮式 T 烯醇式 C A ： T BU (酮 ) ： A T ： A A ： T G) : BU (烯 BU (酮 ) ： A C ： G A ： T C ： G T ： Ｘ T ： A X ： Ｃ Ｃ ： U Ｃ ： Ｇ A HNO2 X G ： C A ： T T ： A 雜交育種 發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種的選育主要采用 誘變育種方法 。 因此 ， 有必要利用 雜交育種方法 。 雜交育種的目的 在于： 1） 通過雜交使不同菌株的 遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換和重新組合 ， 從而改變原有菌株的 遺傳物質(zhì)基礎(chǔ) ， 獲得雜種菌株 （ 重組體 ） ； 2） 可以通過雜交把 不同菌株 的 優(yōu)良生產(chǎn)性能集中于重組體中 ， 克服長期用誘變劑處理造成的 菌株生活力下降等缺陷 ； 3）通過雜交 ，可以 擴大變異范圍 ， 改變產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量 ，甚至出現(xiàn)新的品種 ； 4）分析雜交結(jié)果 ，可以總結(jié) 遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和傳遞規(guī)律 ， 促進(jìn)遺傳學(xué)理論的發(fā)展 。 由于 多數(shù)微生物尚未發(fā)現(xiàn)其有性世代 ， 因此 ， 直接親本菌株應(yīng)帶有適當(dāng)?shù)?遺傳標(biāo)記 。 營養(yǎng)標(biāo)記菌株 （ 即 營養(yǎng)缺陷型菌株 ） 是最常用的遺傳標(biāo)記之一 。由于 基因突變 ， 它失去了 合成某種物質(zhì) （ 氨基酸 、 維生素或核苷酸堿基 ）的能力 ， 在 基本培養(yǎng)基上不能生長 ， 大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加 一定種類的有機物質(zhì) 后 才能生長 。 兩親本的原生質(zhì)體在 高滲條件下 使之混合 ， 由聚乙二醇（ PEG） 作為 助融劑 ， 使它們互相凝集 ， 發(fā)生 細(xì)胞融合 ， 接著兩親本基因組 由接觸到交換 ， 從而 實現(xiàn)遺傳重組 。 原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性 從現(xiàn)有資料看 ， 原生質(zhì)體融合技術(shù) 有以下 優(yōu)點 （ l）去除了細(xì)胞壁的障礙 ，親株基因組 直接融合、交換，實現(xiàn)重組，不需要有已知的遺傳系統(tǒng) 。 （ 2） 原生質(zhì)體融合后 兩親株的基因組之間 有機會發(fā)生 多次交換 ， 產(chǎn)生各種各樣的基因組合而得到多種類型的 重組子 。 （ 3） 重組頻率特別高 ， 因為有聚乙二醇作助融劑 。 （ 5） 可以用溫度 、 藥物 、 紫外線等處理 、 鈍化親株的一方或雙方 ， 然后使之融合 ， 再在再生菌落中 篩選重組子 。 由于以上優(yōu)點 ， 利用原生質(zhì)體融合來培育工業(yè)新菌株已受到國內(nèi)外普遍重視 。 原生質(zhì)體制備 一般采用酶解法除壁 。 一般將原生質(zhì)體放在高滲的環(huán)境中維持它的穩(wěn)定 。在再生細(xì)胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的 重組子 。 篩選優(yōu)良性狀融合重組子 ? 原生質(zhì)體融合后，來自兩親代的遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成的子代稱為 融合重組子。 ? 間接法 把融合液涂布在營養(yǎng)豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出重組子。 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的擴大培養(yǎng) ? 種子擴大培養(yǎng) ：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于 休眠狀態(tài) 的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養(yǎng)而獲得一定 數(shù)量 和 質(zhì)量 的純種過程。 作為種子的準(zhǔn)則 ? 菌種細(xì)胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短； ? 生理性狀穩(wěn)定； ? 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； ? 無雜菌污染； ? 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 ? 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用 液體培養(yǎng)法 (通過搖瓶培養(yǎng)提供比較好的溶氧）。 ? 培養(yǎng)溫度一般為 37?C。 霉菌孢子的制備 ? 霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。 ? 培養(yǎng)時間一般為 4~14天