【正文】 交或后代測(cè)驗(yàn) 早世代選擇，減少群體規(guī)模全基因組選擇第十章RNA干涉：RNA干涉，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在生物體內(nèi)普遍存在的一種古老的生物學(xué)現(xiàn)象，是由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的、由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)基因組測(cè)序及序列組裝的方法（2種）? 依據(jù)基因組的物理圖譜，將重疊群的各個(gè)克隆分別進(jìn)行序列測(cè)定、拼接，再完成各重疊群的序列拼接，最后完成全基因組的序列圖譜“全基因組散彈法”策略：構(gòu)建插入片段約為1～3kb的全基因組DNA文庫(kù)，隨機(jī)挑選一定數(shù)量的克隆進(jìn)行兩端序列測(cè)定，再通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析進(jìn)行序列比較、去除和拼接，最后完成全基因組的序列圖譜 鳥(niǎo)槍法的順序組裝是直接從已測(cè)序的小片段中尋找彼此重疊的測(cè)序克隆，然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸。二、報(bào)告基因報(bào)告基因系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定、常用來(lái)判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織）并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因理想的報(bào)告基因的最基本要求：1）受體細(xì)胞中不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性2）它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞3）具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測(cè) 特性常用報(bào)告基因? b葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）編碼酶的作用底物是無(wú)色的X葡萄糖苷酸（Xglucuronide), 將它變成深藍(lán)色的5溴4氯靛藍(lán)在一定條件下與底物XGluc發(fā)生作用，產(chǎn)生蘭色沉淀反應(yīng)，既可用分光光度計(jì)測(cè)定又可以直接觀察植物組織形成的蘭色斑點(diǎn)當(dāng)加入4甲基傘形酮基葡萄糖苷酸（MUG）底物時(shí)，產(chǎn)生4甲基傘形酮，發(fā)熒光。（4） 載體必須是安全的，不含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生顯著的影響。? ⑤其它與λ噬菌體的合成有關(guān)的基因。? 經(jīng)過(guò) 40～45min 的生長(zhǎng)循環(huán)，釋放出約 100 個(gè)感染性噬菌體顆粒，或者進(jìn)入溶源狀態(tài)（lysogenic state），將基因組 DNA 通過(guò)位點(diǎn)專一性重組整合到宿主的染色體 DNA 中，并隨宿主的繁殖傳給子代細(xì)胞。 有性雜交的胞質(zhì)成分主要為母系遺傳，不可能實(shí)現(xiàn)雜交親本的胞質(zhì)雜交。 物種間生殖隔離阻礙了物種之間的基因交流,從而給作物育種帶來(lái)很大的局限性216。后代穩(wěn)定快 一般無(wú)性系二代就可獲得穩(wěn)定株系，這是優(yōu)良性狀選擇的關(guān)鍵時(shí)期，從而大大地縮短育種年限潛在的隱性性狀和顯性性狀的活化 在無(wú)性系變異后代不但出現(xiàn)顯性性狀的改變，常出現(xiàn)一些供體植株所沒(méi)有的隱性性狀的變異如雄性不育、矮桿等起點(diǎn)高，效率高 選用現(xiàn)行最好的品種（系），作為起始材料，一旦選育出就能超過(guò)現(xiàn)有的品種，不需要多年的適應(yīng)性試驗(yàn)體細(xì)胞無(wú)性系變異的應(yīng)用（這是在育種中的應(yīng)用）一、直接利用體細(xì)胞變異材料二、利用誘變技術(shù)或進(jìn)行定向選擇獲得體細(xì)胞變異材料三、體細(xì)胞突變體的應(yīng)用當(dāng)前在農(nóng)業(yè)上，體細(xì)胞突變體篩選技術(shù)研究主要集中在抗病、 抗鹽、抗除草劑、抗低溫、高溫等逆境脅迫的突變體篩選。(2) 分裂期: 外植體切口邊緣開(kāi)始膨大，外層細(xì)胞通過(guò)一分為二的方式進(jìn)行分裂，從而形成一團(tuán)具有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過(guò)程。據(jù)報(bào)道，由胚培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織較其它外植體容易得到再生植株。（4）加入一定數(shù)量的凝固劑（瓊脂或非態(tài)膠），加熱融化（5）把培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，每個(gè) 25150mm的試管約裝培養(yǎng)基15m1；每個(gè)100ml三角瓶約裝50ml。? KM8P? Kao and Michayluk 1975? 有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，呼吸代謝中的主要有機(jī)酸。? 無(wú)機(jī)鹽濃度高，養(yǎng)分平衡，尤其是銨鹽和硝酸鹽的含量很大? 它不適合生長(zhǎng)緩慢、對(duì)無(wú)機(jī)鹽濃度要求比較低的植物，尤其不適合銨鹽過(guò)高易發(fā)生毒害的植物。? （1）MS培養(yǎng)基? 1962年Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草組織時(shí)設(shè)計(jì)的，是目前應(yīng)用最廣泛的一種培養(yǎng)基。? 它的主要特點(diǎn)與B5相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，是無(wú)機(jī)鹽濃度較高的培養(yǎng)基? 在不少單子葉和雙子葉植物上使用，效果很好。(3)稱出規(guī)定數(shù)量的蔗糖或葡萄糖，加水直到培養(yǎng)基最終容積 。通過(guò)幼胚培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織，經(jīng)植株再生同樣可得到遠(yuǎn)緣雜種。愈傷組織誘導(dǎo)的形成過(guò)程（三個(gè)時(shí)期）植物愈傷組織誘導(dǎo)(callus inducing)： 使那些已分化的體細(xì)胞包括離體的器官、組織和細(xì)胞在人工培養(yǎng)基上，經(jīng)多次細(xì)胞分裂而失去原來(lái)的分化狀態(tài)，形成無(wú)結(jié)構(gòu)的愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程大致經(jīng)歷起動(dòng)期，分裂期和形成期3個(gè)階段（1）起動(dòng)期(誘導(dǎo)期)，外植體已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，通過(guò)脫分化起動(dòng)而進(jìn)入分裂狀態(tài),開(kāi)始形成愈傷組織。③外植體的年齡(生理狀態(tài))與來(lái)源少數(shù)植物如胡蘿卜，幾乎所有的器官都可誘導(dǎo) 產(chǎn)生胚狀體大多數(shù)植物，在目前只有一定發(fā)育時(shí)期的某些器官可產(chǎn)生胚狀體一般以幼嫰組織作外植體較易誘導(dǎo)胚狀體④培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞倍性變化的影響一般由初分離或誘導(dǎo)的或僅經(jīng)過(guò)短時(shí)期培養(yǎng)的愈傷組織，最易產(chǎn)生胚狀體隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，形成胚狀體的能力下降以至完全消失培養(yǎng)細(xì)胞倍性的變化可能對(duì)胚狀體的形成有一定影響⑤內(nèi)源激素水平的變化 外源生長(zhǎng)素對(duì)體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的合成、代謝、極性運(yùn)輸和平衡而起作用的第四章體細(xì)胞無(wú)性系變異：體細(xì)胞培養(yǎng)的任何階段所產(chǎn)生的變異（細(xì)胞，原生質(zhì)體，愈傷組織，再生植株等）統(tǒng)稱為體細(xì)胞無(wú)性系變異體細(xì)胞無(wú)性系變異的特點(diǎn)變異廣泛 包括數(shù)量性狀、質(zhì)量性狀、染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異，DNA擴(kuò)增和減少，生化特性變化等，以數(shù)量性狀變異為主 變異頻率高 棉花體細(xì)胞培養(yǎng)獲得的每一個(gè)再生植株幾乎都存在一定程度的變異。 缺點(diǎn)是：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用原生質(zhì)體融合的意義（應(yīng)用找不到）216。 植物的細(xì)胞質(zhì)控制著很多優(yōu)良的性狀，如線粒體控制胞質(zhì)雄性不育，葉綠體控制的抗除草劑特性216。? 進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其兩端互補(bǔ)單鏈通過(guò)堿基配對(duì)形成環(huán)狀 DNA 分子，并隨宿主細(xì)胞復(fù)制。例如CIII，N，CI，cro和CII等位于λ噬菌體的右半部分。（3） 載體必須具有可供選擇的標(biāo)記，如抗生素標(biāo)記。 Bar基因編碼的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)乙?；饔檬轨⒔z菌素失活。? 操作簡(jiǎn)便快速，轉(zhuǎn)化周期短基因槍轉(zhuǎn)化方法的缺點(diǎn)：? 轉(zhuǎn)化頻率低? 嵌合體較多? 結(jié)果的重復(fù)性差? 轉(zhuǎn)化的外源基因以多拷貝居多易導(dǎo)致基因沉默? 遺傳穩(wěn)定性差? 實(shí)驗(yàn)成本較高? 外源DNA的整合機(jī)理等理論問(wèn)題不清楚第九章近等基因系：個(gè)或多個(gè)形態(tài)上相似，遺傳背景相同或相近，只在個(gè)別染色體區(qū)段上存在差異的遺傳材料，稱近等基因系(Near isogenic lines，NIL)? 遺傳標(biāo)記的發(fā)展階段及各標(biāo)記的特點(diǎn)? 形態(tài)標(biāo)記? 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀，經(jīng)濟(jì)方便，容易觀察記載? 缺點(diǎn)：數(shù)量少，難以建立飽和的遺傳圖? 受環(huán)境影響大? 有些標(biāo)記與發(fā)育不良性狀連鎖? 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記? 能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征? 染色體數(shù)目的變化和染色體結(jié)構(gòu)的變異? 生化標(biāo)記? 主要包括貯藏蛋白、同工酶等標(biāo)記? 優(yōu)點(diǎn)：? 基因表達(dá)的產(chǎn)物，可以直接反映基因產(chǎn)物的差異，受環(huán)境影響較小 ? 缺點(diǎn)：? 標(biāo)記數(shù)量有限，不能滿足遺傳和育種的需要? 每一種同工酶標(biāo)記都需特殊的顯色方法和技術(shù)? 某些酶的活性具有發(fā)育和組織特異性? 分子標(biāo)記? 概念：指在分子水平上可標(biāo)識(shí)的遺傳多態(tài)性? 轉(zhuǎn)換、顛換 插入/缺失 重排? 理想的分子標(biāo)記應(yīng)具有的特點(diǎn)? 高水平的多態(tài)性? 共顯性遺傳（可區(qū)分某一位點(diǎn)的純合或雜合狀態(tài)）? 在基因組中出現(xiàn)的頻率高? 在基因組中均勻分布? 具有中性選擇特征? 容易獲得而且可快速分析? 重復(fù)性好? 分離標(biāo)記所需的費(fèi)用低? DNA標(biāo)記多態(tài)性的分子基礎(chǔ) 分子標(biāo)記多態(tài)性的原理? （一）酶切位點(diǎn)或引物結(jié)合位點(diǎn)的變化? （二）酶切位點(diǎn)或引物結(jié)合位點(diǎn)之間的插入突變? （三）酶切位點(diǎn)或引物結(jié)合位點(diǎn)之間的缺失突變? （四）酶切位點(diǎn)或引物結(jié)合位點(diǎn)之間的重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)的變化? （五）單個(gè)核苷酸的突變遺傳圖譜的構(gòu)建所用的各種群體一、遺傳連鎖圖構(gòu)建的基礎(chǔ) ? 構(gòu)建遺傳圖譜的依據(jù)是同源染色體減數(shù)分裂過(guò)程中會(huì)發(fā)生交換，交換的結(jié)果便使染色體上的基因發(fā)生重組? 兩個(gè)基因之間發(fā)生重組的頻率取決于它們之間的相對(duì)距離? 基因間的遺傳距離用重組率表示，1 cM≈1％的重組率 作圖群體分類? 暫時(shí)性分離群體：回交群體、F2群體以及其衍生群體如F2:3等? 永久性分離群體：重組自交系群體(Rebinant inbred lines，RIL)，加倍單倍體群體(Doubled haploid，DH)等? RIL群體是由F2經(jīng)多代自交一粒傳(Single seed descendant，簡(jiǎn)稱SSD)使后代基因組相對(duì)純合的群體? 永久性群體有兩方面特點(diǎn)：? 群體中各品系的遺傳組成相對(duì)固定，可通過(guò)種子繁殖代代相傳，可不斷地增加新的遺傳標(biāo)記? 可以對(duì)性狀的鑒定進(jìn)