【正文】 冷凍干燥保藏法 、 液氮超低溫保藏法 、 其他干燥保藏法 ，常用的消沫方法有哪幾種？ 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 14 不利因素： 發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減小，氧傳遞系數(shù)減小等。另外，PEG 的脫水作用，擾亂了分散在原生質(zhì)膜表面的蛋白質(zhì)和脂類的排列，提高了脂類膠粒的流動(dòng)性，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體融合。 （ 3）誘變劑插入（移碼誘變劑）： 包括吖啶黃、吖啶橙等吖啶類化合物 。 傳代培養(yǎng) （移植繼代培養(yǎng)） ： 當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞相互接近匯合時(shí)，細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶經(jīng)消化，收集，稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程。 1干細(xì)胞： 一類具自我更新和分化潛能的細(xì)胞。此抗體可明顯降低由鼠源單克隆抗體所致的人抗鼠抗體反應(yīng) 2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)： 外源目的基因?qū)氩溉閯?dòng)物的受精卵或胚胎，目的基因與染色體 DNA 整合；細(xì)胞分裂時(shí)，該目的基因隨染色體的倍增而倍增，使每個(gè)細(xì)胞都帶有 目的基因，在 體內(nèi)能表達(dá)，且能穩(wěn)定地遺傳到下一代。 機(jī)理：結(jié)合水分子，降低組織結(jié)冰速度，提高膜透性。再通過篩選和克隆化培養(yǎng)生產(chǎn)某種預(yù)定性質(zhì)的單克隆抗體，又可在體外無(wú)限增值 HAT 篩選： （ 1） HAT 是含一定濃度次黃嘌呤 H，氨基喋呤 A 及胸腺嘧啶核苷 T 的一種選擇性培養(yǎng)基。 基本特性：專一性強(qiáng)，質(zhì)地均一，檢測(cè)靈敏度極高，可大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)等。 DMSO 能溶解藍(lán)紫色物，顏色深淺與所含藍(lán)紫色物量成正比 細(xì)胞克隆培養(yǎng)及優(yōu)點(diǎn) 定義： 把一個(gè)單細(xì)胞從一個(gè)群體中分離出來單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成為一個(gè)新的細(xì)胞群體的 培養(yǎng)技術(shù)。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基類型？ ； （基礎(chǔ)培養(yǎng)基）； ； 。（第二代單克隆抗體） 1 McAb： 由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞株（或克隆系）產(chǎn)生的抗一種抗原決定簇的抗體。 1細(xì)胞核移植技術(shù) ： 將一個(gè)動(dòng)物的細(xì)胞核移植入去核的未受精卵母細(xì)胞中，并發(fā)育生長(zhǎng)，產(chǎn)生遺傳上同質(zhì)性狀的克隆動(dòng)物技術(shù)（即無(wú)性繁殖）。 接觸抑制性： 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿于附著物表面，相鄰的細(xì)胞表面間相互接觸，使細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞生長(zhǎng)大大減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)，死亡處于動(dòng)態(tài)平衡。 如 5溴尿嘧啶（ 5Bu）、 5氟尿嘧啶（ 5Fu）、 5氨基尿嘧啶、 6氯胸 腺嘧啶、 2氨基嘌呤、 6氯嘌呤和 8氮鳥嘌呤等類似物 。 ？相應(yīng)的分離方法有哪些？ 下游加工過程分為 ： 發(fā)酵液的預(yù)處理 、 初步純化 、 高度純化（精制） 、 成品加工 單元操作 :絮凝、固 液分離、細(xì)胞破碎、沉淀、吸附、膜分離、萃取、離子交換、電泳、結(jié)晶、色譜分離、濃縮、干燥、包裝等 ① 標(biāo)記菌株的篩選 ：兩株親本必須帶有不同的遺傳標(biāo)記 ② 原生質(zhì)體的制備 ：細(xì)菌放線菌 —— 溶菌酶；酵母菌霉菌 —— 蝸牛酶、纖維素酶 菌體需先經(jīng)過預(yù)處理；選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的菌體；選擇合適的酶濃度、酵解時(shí)間、酵 解溫度（ 20~40℃ ）；添加滲透壓穩(wěn)定劑 ③ 原生質(zhì)體的融合： PEG 和 Ca2+ ④ 原生質(zhì)體的再生 ：必須使用再生培養(yǎng)基 ⑤ 融合子的選擇 ，加入滲透壓穩(wěn)定劑的作用是什么，常用的穩(wěn)定劑有哪些？ 原生質(zhì)體對(duì)溶液和培養(yǎng)基的滲透壓很敏感，必須在高滲或等滲透壓的溶液或培養(yǎng)基中才能維持其生存，低滲透壓溶液中，原生質(zhì)體將會(huì)破裂而死亡。 PH 、 基質(zhì)濃度 、 溶解氧濃度 、 氧化還原電位 、 產(chǎn)物濃度 、 廢氣中的氧濃度 和 廢氣中的 CO2濃度 。 此法可以避免酶反應(yīng)過程的底物抑制現(xiàn)象 ③ 連續(xù)式反應(yīng)器： 一邊連續(xù)地將底物溶液加入反應(yīng)器中，一邊連續(xù)地使反應(yīng)液以相同流量排出反應(yīng)器 。 本法又分為（ 1）交聯(lián)酶法、（ 2）酶與輔助蛋白交聯(lián)法、（ 3）吸附交聯(lián)法、（ 4）載體交聯(lián)法 ④ 包埋法 ： 分為凝膠包埋法及微囊化包埋法兩類 優(yōu)點(diǎn)： 制備固定化酶的操作條件溫和，不改變酶的結(jié)構(gòu)，操作時(shí)保護(hù)劑及穩(wěn)定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細(xì)胞器及細(xì)胞的固定化。 三、 問答題 ？什么是酶工程？ 酶具有以下特性： 酶是蛋白質(zhì)； 酶的催化效率非常高 ； 酶具有高度的專一性； 酶的反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓） ； 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。 PCR 反應(yīng)的必要條件 ：須知基因兩端的部分序列 PCR 反應(yīng)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素 ： Taq DNA 聚合酶 ； 引物的長(zhǎng)度 ； 模板 。 （ 克服的方法是將 5?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的 5‘OH所取代。 ②用一串連的終止密碼，而不是只是一個(gè)終止生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 8 密碼，以保證翻譯有效終止 。 的穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)： ①利用 RNase 缺失的受體菌 。 RNA和 mRNA。 ④ 基因組文庫(kù)法 :從基因組文庫(kù)所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá)，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等的真核表達(dá)系統(tǒng)。 四、問答題 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 7 ？各有哪些特點(diǎn)？ ① 基因分離的物理方法 ： 根據(jù) DNA 分子的兩條鏈存在著 G≡ C， A=T 堿基配對(duì)。 基本步驟 ①獲得目的基因 ； ②在體外，將帶有目的基因的外源 DNA 片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇性標(biāo)記的載體分子上，形成重組 DNA 分子；③將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖；④從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組 DNA 分子的宿主細(xì)胞克隆；⑤從這些篩選出來的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò) 增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 接頭法（ adaptor） ： 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 6 是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。獲得具有新遺傳性狀的生物細(xì)胞的過程。 : 能從其周圍攝入 DNA 的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。 ： 指多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。 ： 利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（ dNTP)加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3′ OH 上。在洗脫過程中， PEG 將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。 由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段： 1)外植體細(xì)胞脫分化 ： 外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。特點(diǎn)：效果好，易于成功；簡(jiǎn)便易行；不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)過程； ④ 微室培養(yǎng) ： 人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。 植物原生質(zhì)體發(fā)育及植株再生途徑主要有：細(xì)胞壁再生；細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)；愈傷組織形成與分化；植株再生 制備植物原生質(zhì)體過程中，酶解去細(xì)胞壁時(shí)，為保證原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，常加入 滲透穩(wěn)定劑 (①糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等；②鹽溶液系統(tǒng)：包括 KCl、MgS04 和 KH2PO4 等 )。 細(xì)胞分化： 是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功 能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture)： 將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 愈傷組織： 脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無(wú)組織結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。 三、填空題： 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方式主要有：分批培養(yǎng)法 ，連續(xù)培養(yǎng)法，半連續(xù)培養(yǎng)法和固定化培生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 2 養(yǎng)法 誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合的因素主要有： PEG 誘導(dǎo)； NaNO3 誘導(dǎo)；高鈣和高 PH誘導(dǎo)；高鈣和高 PH 及 PEG 結(jié)合誘導(dǎo) 一般認(rèn)為形成的器官的類型受培養(yǎng)基中兩類激素的相對(duì)濃度的控制，較高濃度的 生長(zhǎng)素 有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，較高濃度的 細(xì)胞分裂素 則促進(jìn)芽的形成而抑制根的形成。用途：誘導(dǎo)形成單細(xì)胞系。 (somatic embryo)： 指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長(zhǎng)成完整植株。 特點(diǎn)： 無(wú)物種限制；雜種含雙親性質(zhì) PEG 融合與電融合的基本原理是什么？各有何特點(diǎn)？ ① PEG融合 : 原理 ： PEG 是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。其目的是為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)。 ： 是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)程度，是位于結(jié)構(gòu)基因 5′端上游的一段 DNA 序列，能 夠指導(dǎo)全酶同模板正確結(jié)合，活化 RNA 聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。 條件：只要目的基因在宿主中表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)，并能獲得相應(yīng)抗體，即可用本技術(shù)檢測(cè)相應(yīng) DNA。 Transformation: 自然的轉(zhuǎn)化是指將攜帶某種遺傳信息的 DNA 分子引入宿主細(xì)胞，通過同源重組作用。因此， IPTG 被稱為β半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物。、安全可靠、穩(wěn)定性好 . DNA 轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的 方法 ① CaCl2 處理后的細(xì)菌轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染； ②高壓電穿孔法；③聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化；④磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；⑤原生質(zhì)體融合；⑥脂質(zhì)體法；⑦細(xì)胞核的顯微注射法；⑧激光打孔技術(shù)。 ，主要表達(dá)方式 非融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)；融合蛋白的胞內(nèi)表達(dá)；分泌表達(dá)。 cDNA文庫(kù)最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細(xì)胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成 mRNA的那些基因序列 。 . 文庫(kù)的建立有哪些步驟 ? 。 ** ：選擇強(qiáng)的可調(diào)控的啟動(dòng)子 。 序列上終止密碼的選擇 : ①首選 UAA。 當(dāng)它的平末端與平末端的外源 DNA 片段連接后，便會(huì)使后者成為具有粘性末端的 新的 DNA 分子，而易于連接重組； 缺點(diǎn) ：各個(gè) DNA 接頭分子的粘性末端之間，會(huì)通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)作用，形成如同 DNA 銜接物一樣的二聚體分子，失去接頭的本來意義。 技術(shù)： 是指在四種脫氧核苷三磷酸（ dNTP）存在下，以寡聚核苷酸為引物，以單鏈DNA 為模板，經(jīng) DNA 聚合酶催化，合成 DNA 互補(bǔ)鏈達(dá)到基因擴(kuò)增目的的過程。 年國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)酶學(xué)委員會(huì)根據(jù)反映類型 ，將酶類分為 氧化 還原酶 、 轉(zhuǎn)移酶 、 水解酶 、 裂合酶 、 異構(gòu)酶 、和 連接酶 。 ③ 交聯(lián)法 ： 采用雙功能或多功能試劑使酶分子內(nèi)或分子間彼此連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而使酶固定化的技術(shù)。此法靈活性大，適合小批量、多品種的生產(chǎn)，并且 由于充分?jǐn)嚢?，使反?yīng)罐內(nèi)底物和產(chǎn)物濃度、 溫度 、 PH 處處相等且底物和產(chǎn)物濃度