iywaaa生物技術(shù)制藥-(存儲版)
【正文】 孔細胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。 ? 染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體，而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細胞分泌抗體的能力較低。動物體內(nèi)誘生法操作簡便，也比較經(jīng)濟，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株，缺點是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。 六、單克隆抗體的純化 ? 動物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過程 ? 澄清和沉淀處理 ? 小鼠腹水中含有紅細胞、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力 1000g離心 5min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)；再用 ?m的微孔濾膜過濾，除掉污染的細菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體， 50%飽和硫酸銨能回收 90%以上的單克隆抗體。 ? 續(xù)（ 2）離子交換法 ? 在最適離子強度及 pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化 25~100倍。 一、人 鼠嵌合抗體 ? 制備方法：提取雜交瘤細胞系的 mRNA， 經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， 并以其為模板，采用特異引物，用 PCR方法分別擴增 VL和 VH基因，再分別連接真核表達所需的上游啟動子、前導(dǎo)肽序列和下游剪切供體信號、增強子真核調(diào)控序列后，將 VL基因克隆到人 Ig的 CL基因表達載體上，將 VH基因克隆到人 IgG1的 C基因真核表達載體上，再將人 鼠嵌合的 VC區(qū)基因質(zhì)粒 DNA等量混合，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞 SP2/0， 轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進行篩選，形成集落的細胞即為共轉(zhuǎn)染細胞，所分泌的抗體為嵌合抗體。書中表 45給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用。（ 5）最小識別單位（ MRU）是由單個 CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體，親和力較低。（ 40受體FV型融合蛋白。 ? 淘篩：抗原固定化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復(fù)與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量擴增。免疫標(biāo)記技術(shù)有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù) 二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 熒光抗體診斷試劑 ? 熒光色素如異硫氰酸熒光素（ FITC） 等標(biāo)記抗體球蛋白，即成為熒光抗體。比如 ELISA方法（夾心法、間接法）。 三、基因工程抗體的表達 ? 原核細胞表達 ? 真核細胞表達 ? 轉(zhuǎn)基因植物表達 ? 轉(zhuǎn)基因動物表達 第五節(jié) 抗體診斷試劑 ? 一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑 ? 鑒定病原菌的抗體試劑：診斷血清制備步驟：（ 1）制備細菌抗原， O（ 菌體）抗原， H（ 鞭毛）抗原；（ 2）免疫動物和制備抗體血清 ? 乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg） 的反向被動血凝診斷試劑 ? 妊娠診斷試劑 ? 抗 ABO血型系統(tǒng)血清 二、免疫標(biāo)記技術(shù)用的抗體類試劑 ? 給抗體標(biāo)記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應(yīng)放大，使常規(guī)方法難以觀察或檢測的反應(yīng)得以顯現(xiàn)，因而大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性，用于對微量抗原物質(zhì)進行定性或定量檢測，結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù)，還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細胞內(nèi)的定位測定。如加入一段有疏水性和一定伸展性的長鏈，可緩解兩種蛋白的相互干擾。（ 2） 配基 Ig嵌合型蛋白，如 IL2Ig。有分子量小、穿透力強、免疫原性小特點，可與效應(yīng)分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。抗體分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。 ? 如將鼠源性單克隆抗體的 C區(qū)用人的 Ig分子的 C區(qū)置換，則對人的免疫原性消失。 IgG2b、 IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。 并能收獲更多的單抗。因為雜交瘤細胞的兩種親本細胞均來自 BALB/c小鼠，所以應(yīng)選用 BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。小鼠骨髓瘤細胞的染色體數(shù)變異較大， SP2/0細胞為 62~68， NS1細胞為 54~64，大多數(shù)為非整倍性，并且有中部著絲點染色體和亞中部著絲點染色體。 ? 一般融合后獲得的 雜交瘤細胞要經(jīng)過大約 3次的克隆化，才能達到 100%孔內(nèi)均為抗體陽性細胞克隆。一般認為飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。 二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) ? （ 4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（ H）、 氨基喋呤（ A） 和胸腺嘧啶（ T） 配制的。書中表 41列舉了主要的骨髓瘤細胞系，其中 SP2/0、 ，細胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞只分泌均一的、完全來自脾細胞的抗體分子，它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細胞。顆粒性抗原（如細菌、細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注
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