【正文】 定點(diǎn)突變。 要突破生物有性繁殖和無性繁殖的界限應(yīng)該從它們的共性出發(fā)，從操作細(xì)胞開始。 動(dòng)物細(xì)胞的全能性？ 長(zhǎng)期認(rèn)為在動(dòng)物發(fā)育的早期胚胎階段，每個(gè)胚胎細(xì)胞都具有全能性，但是隨著胚胎發(fā)育，胚胎細(xì)胞逐漸失去了這種全能性而開始功能分化，有的發(fā)育成神經(jīng)組織，有的發(fā)育成肌肉組織。 由于體細(xì)胞包含有全部的遺傳信息， 可以從體細(xì)胞獲得完整的動(dòng)物個(gè)體 。 第七節(jié) 遺傳病 ——基因診斷 和基因治療 一、基因診斷 □ 感染性疾病的診斷： 人類感染了外源的病毒、細(xì)菌等引起的傳染性疾病的診斷可以直接分析患者的組織、器官或血液等來確定是否有外來病源性生物的基因。 突變攜帶者 （ 雜合子 ） ， 其 β珠蛋白等位基因中 ， 一個(gè)是正常的基因 ， 它有 3個(gè)切點(diǎn) ， 切成 2個(gè)片段；另一個(gè)攜帶突變的基因片段中只有 2個(gè)切點(diǎn) ， 產(chǎn)生一個(gè)大的片段 。 （ 2） 退火 ， 將反應(yīng)系統(tǒng)降至 55℃ ， 使引物能與模板單鏈 DNA的特定部位配對(duì)結(jié)合 。 （ 2）．從被測(cè)對(duì)象的細(xì)胞中提取 DNA，用酶切成較小的片段，并對(duì) DNA作熒光標(biāo)記，并熔解成單鏈。 （ 2） ． 生殖細(xì)胞基因治療： 將正常基因?qū)牖颊叩纳臣?xì)胞 、 受精卵或早期胚胎細(xì)胞中， 使這類細(xì)胞中的某些異常基因的功能得以恢復(fù) ， 最終發(fā)育成正常個(gè)體 。 （ 3） ． 用重組病毒感染體外培養(yǎng)的 T淋巴細(xì)胞 ， 使正常 ADA基因插入到 T淋巴細(xì)胞基因組中 。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，因 此而死亡的不下 3000人。 1990年 ， 美國(guó)第一次對(duì) SCID病人作基因治療 ，其步驟為： （ 1） ． 將正常 ADA基因與反轉(zhuǎn)錄病毒載體相連 ， 構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體 。 □ 基因治療的類別： 根據(jù)基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的不同 ， 可分為體細(xì)胞基因治療和生殖細(xì)胞基因治療 。該技術(shù)可用于大規(guī)模篩查由基因突變引起的疾病。再對(duì)擴(kuò)增樣品作酶切和電泳，其結(jié)果可直接從電泳圖獲得：該法簡(jiǎn)便，只需微量細(xì)胞就可作出診斷。 下圖為正常和異常蛋白 、 基因和內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)變化圖 。供體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)， TRF越短 . □ 動(dòng)物克隆的危險(xiǎn)性： 1． 克隆動(dòng)物已出現(xiàn)廣泛的免疫缺陷或早期夭亡 。 體細(xì)胞克隆可達(dá)到親代個(gè)體的自我復(fù)制。 2. Guha， 1964， 曼陀羅花藥培養(yǎng)成單倍體植株 。名詞 clone意指無性繁殖（系），作為動(dòng)詞意指產(chǎn)生無性繁殖系的過程，所以 clone 可以稱為無性繁殖或復(fù)制 現(xiàn)在的克隆技術(shù)可分為三個(gè)層次：基因、細(xì)胞、個(gè)體。 基因敲除（ gene knock out） 是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上將該基因去除，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物象一個(gè)活的發(fā)酵罐一樣來生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物。將這種酶的基因分離出來，再根據(jù)該基因序列結(jié)構(gòu)合成它的互補(bǔ)基因，再將這種互補(bǔ)基因轉(zhuǎn)入到西紅柿植株中，它將會(huì)產(chǎn)生出一種與上述蛋白酶基因正常轉(zhuǎn)錄的 mRNA相互補(bǔ)的 mRNA（ 稱反義 RNA），并且與之結(jié)合成雙鏈，使之不能正常翻譯成催化西紅柿成熟的蛋白酶。 Ti質(zhì)粒上的一段 DNA能轉(zhuǎn)移到侵染的植物部位細(xì)胞中，并插入到植物染色體中，由于該片段（稱 TDNA）上具有誘發(fā)腫瘤的基因，所以能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。 重組后由于多角體蛋白基因已被外源基因所取代 ， 只能產(chǎn)生無多角體的空斑（ occ） 。 多角體包含體的組成 ?桿狀病毒基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)式時(shí)序調(diào)控 桿狀病毒的基因表達(dá)分為 4個(gè)時(shí)期：極早期（ immediateearly, α） 、 晚早期 (delayedearly,β)、晚期 (late, γ)和極晚期 (very late, δ)。 target protein (B) Westernblot of the purified target protein. Guinea pig polyclonal antiserum against human F antigen was used as primary antibody. (A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B) 二、用真核細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)基因工程藥物 雖然用大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)基因工程藥具有許多優(yōu)點(diǎn) ， 如成本低等 ， 但由于原核系統(tǒng)表達(dá)的真核基因蛋白有時(shí)缺乏生物活性 ， 其原因由于原核生物缺乏合適的轉(zhuǎn)譯后修飾機(jī)制 。 F抗原純化與鑒定 離心后所得包涵體蛋白經(jīng)過初步純化和溶解后 ， 經(jīng)過親和層析柱 （ Ni2+charged IDA Hisbind column） 純化 ， 得到一分子量約為43kD的單一蛋白帶 （ 8） 。 The method used to synthesize rebinant human insulin. 1915 溴化氰 例子 大鼠肝臟 F抗原 蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá) F蛋白定位在肝細(xì)胞漿中 ， 正常人肝組織中的 F蛋白含量是血清中 1370倍 ， 只有肝細(xì)胞被破壞時(shí) ， F抗原才釋放到血漿中 ， 使血清中 F抗原含量升高 ， F抗原用作肝病診斷 ， 首先需獲得純的 F抗原 。 基因工程 □ 定義：根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì) DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 如何解開這個(gè)謎 ？ Sanger回答了這個(gè)問題： 在基因組中存在重疊基因 ！ 重疊基因 定義：在一種蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列中包含了另一種蛋白質(zhì)的編碼序列，所不同的是各自以不同的讀碼框轉(zhuǎn)譯。 三，克隆基因的定點(diǎn)誘變 □ 意義 ：基因的功能通常是通過其突變體來認(rèn)識(shí)其作用的。該方法可用于重組質(zhì)粒鑒定，轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的插入位置，遺傳病的分子診斷等。 Shuttle Vectors 第四節(jié) 重組 DNA方法學(xué) 一 、 克隆戰(zhàn)略 1． 無選擇地從一個(gè)限制酶切的混合物中克隆全部片段 ， 然后再篩選所需的目的基因 。 A Petri plate showing the growth of bacterial cells after uptake of rebinant plasmids. 166 菌落原位雜交篩選和鑒定克隆的基因 根據(jù)重組質(zhì)粒中的目的基因的序列，合成一段與之互補(bǔ)的 DNA序列，并使其標(biāo)記上放射性同位素，該段 DNA稱為探針。 EcoRI ↓ C C G A A T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接頭 ↑ EcoRI ＋ T4DAN 連接酶 人工接頭 EcoRI 外源 DNA 粘性末端用于連接載體 人工接頭的應(yīng)用 四 、 載體 Vectors 能使克隆的片段不斷復(fù)制的一類 DNA分子稱載體 ， 應(yīng)具備以下特點(diǎn)： （ 1） 分子量小 ， 核苷酸序列清楚 ， 具有一些單一酶切位點(diǎn)或人工插入的多克隆位點(diǎn)區(qū) 。 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取和基因文庫的構(gòu)建 各種生物的特定組織 （ 如血液 、 肝臟 、 植物組織 、 細(xì)菌細(xì)胞等 ）都含有大分子量的 DNA。 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 （ 1） 獲得目的基因 ， 一般是有重要生物學(xué)功能的外源基因 。 2． 方法要點(diǎn)：特定來源的 DNA經(jīng)不同的酶消化后 ， 樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 ， 可得到限制位點(diǎn)的圖譜 。 ?在宿主限制現(xiàn)象中有兩個(gè)相互的過程： （ 1） 由于宿主核酸酶的作用破壞了侵入的噬菌體 DNA， 從而 限制 了噬菌體的繁殖； （ 2） 噬菌體 DNA修飾 免除了限制酶的作用 。用 S1核酸酶處理，消除單鏈。 海膽組蛋白基因在較底溫度時(shí)（ 61℃ ）的變性電鏡圖，每種組蛋白基因被一個(gè)富含 A－ T對(duì)區(qū)域間隔開。 如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一個(gè)甲基后就能保護(hù) DNA免受核酸酶的攻擊 ， 該過程稱 甲基化作用 （ methylation） 。 從圖上任何兩個(gè)切點(diǎn)之間的距離可估計(jì)出核苷酸的數(shù)目 。 第三節(jié) 重組 DNA ? 在細(xì)菌細(xì)胞中選擇性地?cái)U(kuò)增特定DNA 片 段 的 過 程 稱 分 子 克 ?。?molecular cloning） 。 （ 3） 采用聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） 特異性地?cái)U(kuò)增某一目的基因的片段 。 TTAA AATT 5, 3, 3, 5, 5, 3, 3, 5, AAA AAAA 5, 3, 5, 3, AAA AAAA TT TTT TT TT AAAA AAAAA T TT TT TT TT 5, 3, 3, 5, 5, 3, 3, 5, 5, 3, 5, 3, E coRI 外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 dATP shear 外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 dTTP TTTT TTTTT Plasmid DNA Drosophila DNA DNA polymerase,DNA ligase 末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾，如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端，就可以連接成重組質(zhì)粒 2． 人工接頭的應(yīng)用 人工接頭是一個(gè)合成的含有特定限制酶識(shí)別順序的核苷酸片段。 挑選出白色菌落可作進(jìn)一步鑒定。 某些載體質(zhì)粒既具有 ， 又具有動(dòng)物病毒 SV40的復(fù)制起點(diǎn) ， 這樣的質(zhì)粒既可在 ， 又可在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制， 應(yīng)此稱為穿梭載體 。 Southern發(fā)明了一種對(duì)電泳凝膠中的 DNA作分子雜交鑒定的方法。例舉兩種鑒定該基因的具體方法，要求寫出實(shí)驗(yàn)步驟，并且用圖表示鑒定結(jié)果。 發(fā)現(xiàn)了重疊基因 Sanger等最早對(duì) Φ 174病毒作 DNA序列分析 ， 該病毒基因組全長(zhǎng) 5400bp， 共編碼 9種蛋白質(zhì) ， 但根據(jù)該 9種蛋白質(zhì)分子量推算其編碼區(qū) ， 明顯超過病毒基因組5400bp長(zhǎng)的核苷酸所能編碼的容量 。 第六節(jié) 基因工程 由基因工程方法產(chǎn)生的生物稱為轉(zhuǎn)基因生物 ， 它一般是指由導(dǎo)入外源 DNA的細(xì)胞發(fā)育而成的生物 。 □ 人生長(zhǎng)激素是治療侏儒癥 ， 青少年增高和促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)的藥物 ， 生長(zhǎng)激素具有種屬特異性 ， 從動(dòng)物腦組織來源的生長(zhǎng)激素不能用于人類 ， 之前只能從剛死亡的人大腦垂體中分離純化 ， 來源極有限；而且發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)對(duì)人類有毒副作用 。且在該表達(dá)系統(tǒng)中得到高表達(dá)， 外源蛋白表達(dá)量約占全菌總蛋白的 40%。 induced by IPTG。幾個(gè)病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質(zhì)中成為一個(gè)多角體包含體。 Transfer vecter Pp Cloned gene Pt 5, 3, Polyhedrin gene AcMNPV DNA Rebinant AcMNPV Fig. 共轉(zhuǎn)染發(fā)生同源重組獲得重組病毒 野生型病毒感染的昆蟲細(xì)胞由于存在多角體基因 ， 空斑測(cè)定時(shí)產(chǎn)生有多角體的空斑（ occ+） 。其形成的機(jī)理是由于 農(nóng)桿菌 中含有的一種誘發(fā)腫瘤的質(zhì)粒所引起的，稱為 Ti質(zhì)粒（ tumorinducing plasmid，簡(jiǎn)稱 Ti質(zhì)粒）。