【正文】 ors 具有合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始信號(hào) ， 外源基因插入合適的區(qū)域后能夠表達(dá)的載體 。 當(dāng)外源基因插入到多克隆位點(diǎn)區(qū)后就阻斷了 Lac Z基因的編碼區(qū)，使 Lac Z基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這些細(xì)胞就不能利用 Xgal，結(jié)果在培養(yǎng)基上形成 白色的菌落。 缺點(diǎn)：加入的 polyA和 polyT可能影響基因表達(dá)；外源基因克隆擴(kuò)增后不能用限制酶重新從重組質(zhì)粒中切出來(lái) 。 （ 2） 以 mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的 DNA， 稱(chēng) cDNA， 并構(gòu)建 cDNA克隆 。 要求標(biāo)出 EcoRI、 HindⅢ 和 BamHI的位點(diǎn)和它們間的距離 。 從正向和反向閱讀是同一句子： ABLE WAS I ERE I SAW ELBA 幾種限制酶的名稱(chēng)和識(shí)別序列 T↓C T A G A A G A T C↑T Xba I C T G C A↓G G↑A C G T C Pst I A↓A G C T T T T C G A↑A Hind III G A T↓A T C C T A↑ T A G EcoR V G↓A A T T C C T T A A↑G EcoR I G↓G A T C C C C T A G↑G Bam H I 識(shí)別位點(diǎn)序列 內(nèi)切酶 四 、 限制酶作圖 1． 在 DNA分子上確定限制酶切點(diǎn)的相對(duì)順序是一種重要的染色體作圖法 。 ☆ 怎樣保護(hù)宿主自身的 DNA和感染性 X－ A噬菌體 DNA免受宿主核酸酶的攻擊 ？ 有一種酶能在特定序列上修飾特異性堿基 ， 但是并不改變這些堿基的編碼性質(zhì) 。 組蛋白是與核 DNA結(jié)合的堿性蛋白 ， 富含精氨酸 ， 其編碼區(qū)相對(duì)富含 G－ C對(duì) 。 H1 H2A H3 H2B H4 二 、 互補(bǔ)單鏈的復(fù)性 利用互補(bǔ)單鏈復(fù)性的特點(diǎn)可以確定基因缺失的位置和大?。阂粋€(gè)缺失突變體的 DNA和一個(gè)野生型的 DNA一起復(fù)性后就可確定缺失區(qū) 。 Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not 三 、 限制酶的特異性 1970年 ， Hamilton Smith從流感嗜血桿菌 d株分離到能識(shí)別特定核苷酸序列 ， 切點(diǎn)專(zhuān)一的限制酶－ HindII ↓ 5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’ 3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’ ↑ Smith進(jìn)一步證明宿主誘導(dǎo)的甲基化作用保護(hù)了具有同樣序列的 DNA免受 HindII的切割： ↓ m 5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’ 3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’ m ↑ * * Py： pyrimidine Pu： purine R質(zhì)粒的一個(gè)基因產(chǎn)生的限制酶 EcoRI， 它對(duì) SV40病毒的環(huán)狀 DNA分子上只有一個(gè)切點(diǎn) 。 1 2 3 4 5 5, 3, 3, 5, 酶 1 酶 2 1 2 3 4 5 32P 32P 酶 1 酶 2 Digestion 1 2 3 4 5 32P 1 2 3 4 5 32P 32P A B C D E F (a) (b) 32P 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 酶 2 A B C 1 2 3 4 5 D E F 1 2 4 5 酶 1 (a) (b) 根據(jù)重疊的亞片段排列原先片段的順序 亞片段 位于原先片段 1 2 3 4 5 A D A E B E B F C F (c) 3 根據(jù)重疊的亞片段排列原先片段的順序 ， 可以得到一個(gè) DNA的酶切圖譜 。 （ 2） 在限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶的作用下 ， 將目的基因與克隆載體相連接 ， 組成一個(gè)新的重組 DNA分子 （ rebinant DNA （ 3） 將重組 DNA分子引入受體細(xì)胞 ， 并在細(xì)胞中進(jìn)行 DNA復(fù)制 ， 最常用的受體細(xì)胞為大腸桿菌 。 由于目的基因位于整個(gè)基因組 DNA中 ，難以檢出和分離 ， 可以先將基因組 DNA用內(nèi)切酶切成較小的片段， 再將它們分別與載體相連 ， 并轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行繁殖和擴(kuò)增， 再對(duì)各個(gè)不同的克隆作出檢定 。 （ 2） 分子中具有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn) ， 能使載體自身和插入的外源 DNA共同復(fù)制 。再用探針與菌落中的 DNA進(jìn)行雜交，可從許多未知的菌落中挑選出克隆有目的基因的菌落。 非選擇性地在細(xì)菌中克隆一個(gè)高等生物的隨機(jī) DNA片段的方法稱(chēng)為鳥(niǎo)槍法 （ Shotgunning） ，全部克隆的集合體稱(chēng)為一個(gè)基因文庫(kù) （ gene bank, or gene library） 。 單鏈 DNA能結(jié)合到硝酸纖維濾膜上，酶切物經(jīng)電泳后，瓊脂糖膠作變性處理，然后將 DNA吸印到膜上，用 32P標(biāo)記的 DNA或 RNA探針與膜上的 DNA作雜交，自顯影后可顯示出目的基因的位置和大小。在 重組 DNA 技術(shù)中常需研究 DNA 序列上特定部位的功能，或改變 基因編碼區(qū)個(gè)別氨基酸的密碼子以提高該基因表達(dá)蛋白質(zhì)活性 等。 Φ 174病毒的重疊基因如下： A B C D J F G H E 重疊基因概念與密碼子的非重疊性 Sanger采用獨(dú)創(chuàng)的序列分析方法對(duì) Φ 174病毒基因組作序列分析，提出了令世人驚訝的重疊基因概念，是對(duì)基因認(rèn)識(shí)的重大發(fā)展。 一、利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物 利用基因工程技術(shù)不但能得到大量的具有特殊功能的基因。目前國(guó)內(nèi)外大多采用生化提取的方法從人肝臟組織中分離 F抗原 ， 由于難以得到 F抗原純品 ， 給大量制備診斷試劑帶來(lái)困難 。 表達(dá)產(chǎn)物的 Westernblot鑒定結(jié)果顯示：該表達(dá)蛋白可與豚鼠抗人 F 蛋白的抗血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) ， 在硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)一條分子量為 43kD的顯色帶 （ ） SDSPAGE and Westernblot of the expressed F Antigen (A) molecular weight standard。 因此用真核細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)基因工程藥物已受到重視 。 通常 ， 每一后續(xù)時(shí)期基因的表達(dá)水平都高于前一時(shí)期基因表達(dá)的水平 ， 其中極晚期基因表達(dá)水平顯著提高 ， 這也是構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ) 。 在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)折光率的不同可區(qū)分這兩種不同表型的空斑 。 TDNA Tumor production Nopaline synthesis TDNA transfer function Nopaline utilization Origin of replication Ti plasmid Ti質(zhì)粒（胭脂堿型）簡(jiǎn)圖 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 2. 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒作為植物基因工程載體 科學(xué)家根據(jù)冠癭瘤形成的分子機(jī)理，通過(guò)改建農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒，使 Ti質(zhì)粒中的致瘤基因失活，同時(shí)插入目的基因，使之成為基因工程載體。未成熟的西紅柿易于長(zhǎng)期保存保鮮和運(yùn)輸。 采用上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因羊，可從羊奶中提取出治療心臟病的藥物 tPA（組織溶解酶原激活劑）。 這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分 觀察整體 推測(cè)功能的三部曲思想相似 。 . 克隆技術(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ) ——細(xì)胞及細(xì)胞的全能性 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說(shuō)，細(xì)胞是一切生物體的結(jié)構(gòu)和功能單位，無(wú)論是進(jìn)行有性繁殖還是進(jìn)行無(wú)性繁殖的生物，都是有細(xì)胞構(gòu)成的。 ， 1971， 煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)成植株 。 □ 核移植技術(shù) 將供體復(fù)制對(duì)象的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中 。 2． 克隆動(dòng)物過(guò)程中也極有可能產(chǎn)生遺傳性的變異（ 無(wú)性系變異 ） ， 這在植物的克隆中已廣泛得到研究和驗(yàn)證 （ 會(huì)發(fā)生染色體變異 ， 基因組 DNA擴(kuò)增和某些轉(zhuǎn)位因子的激活 ） 。 β—珠蛋白基因 —————————————————— ///////// 內(nèi) 含 子 /////////////////////////// —————————————————— ↑ ↑ ↑ M M M （在異常中消失） — 脯 ——纈 ——谷 — —CC T—GTG—GAG— Mst II識(shí)別位點(diǎn)消失 異常 S — 脯 ——谷 ——谷 — —CC T—GAG—GAG— Mst II識(shí)別位點(diǎn) 正常 A 氨基酸序列和基因序列 血紅蛋白類(lèi)型 ( 3 ). Southern雜交檢測(cè)鐮形細(xì)胞貧血癥 提取羊水或絨毛細(xì)胞 DNA， 用限制性?xún)?nèi)切酶 Mst II對(duì) DNA酶解 ， 經(jīng)電泳和 Southern吸引轉(zhuǎn)膜后 ， 用放射性標(biāo)記的 β株蛋白基因探針對(duì)膜上的 DNA作雜交 ， 根據(jù)經(jīng)放射自顯影后的膠片上雜交斑點(diǎn)的多少和位置可作出診斷： 正常人的 β珠蛋白基因 （ βAβA） 中有 3個(gè) Mst II切點(diǎn) ， 可將該DNA上切成 2個(gè)片段 ， 它們?yōu)? ， 因此會(huì)在相應(yīng)位置產(chǎn)生二條雜交帶；異?；颊叩?β珠蛋白基因 （ βSβS）中 ， 只有 2個(gè)切點(diǎn) ， 可將該 DNA切一條長(zhǎng) 。 正常 異常 攜帶者 電 泳 ↓ □ PCR原理 （ 1） 變性 ， 在 95℃ 高溫下模板雙鏈 DNA解開(kāi)成單鏈DNA。 □ 檢測(cè)原理和步驟 ： (1)．制作芯片：根據(jù)疾病基因中的突變位點(diǎn)區(qū)域的核苷酸序列合成 20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的探針，將其固定于芯片上，芯片上可固定成千上萬(wàn)個(gè)探針。 （ 1） ． 體細(xì)胞基因治療： 將正常的外源基因?qū)氲交颊咛囟ǖ捏w細(xì)胞中 ， 并使其正常表達(dá) ， 合成患者所缺的某種蛋白質(zhì)或酶 ， 使患者的癥狀得以改善 。 （ 2） ． 從患體體內(nèi)分離有免疫缺陷的 T淋巴細(xì)胞 。 美國(guó)的梅毒試驗(yàn) 1932年，美國(guó)在 Tuskegee鎮(zhèn)對(duì) 感染梅毒的 25~60歲的男性黑人 進(jìn)行“梅毒自然史“的研究 時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 40年之久 如此不文明的行為 為什么會(huì)發(fā)生在一個(gè) 最文明的時(shí)代 最文明的國(guó)家 最文明的群體？ 科學(xué)與人文的攜手 ? 什么是生命倫理學(xué) BIOETHICS 在跨學(xué)科、跨文化的背景下，對(duì)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的倫理學(xué)，包括道德見(jiàn)解，判斷，行為，政策等進(jìn)行系統(tǒng)的研究 生命倫理學(xué)關(guān)注的若干熱點(diǎn)和難點(diǎn) 輔助生殖 克隆技術(shù) 人類(lèi)基因組研究 轉(zhuǎn)基因食品 胚胎干細(xì)胞 輔助生育的倫理道