【正文】 （ 2） ． 從患體體內(nèi)分離有免疫缺陷的 T淋巴細(xì)胞 。 □ 檢測原理和步驟 ： (1)．制作芯片：根據(jù)疾病基因中的突變位點(diǎn)區(qū)域的核苷酸序列合成 20個(gè)核苷酸長的探針，將其固定于芯片上，芯片上可固定成千上萬個(gè)探針。 β—珠蛋白基因 —————————————————— ///////// 內(nèi) 含 子 /////////////////////////// —————————————————— ↑ ↑ ↑ M M M （在異常中消失） — 脯 ——纈 ——谷 — —CC T—GTG—GAG— Mst II識(shí)別位點(diǎn)消失 異常 S — 脯 ——谷 ——谷 — —CC T—GAG—GAG— Mst II識(shí)別位點(diǎn) 正常 A 氨基酸序列和基因序列 血紅蛋白類型 ( 3 ). Southern雜交檢測鐮形細(xì)胞貧血癥 提取羊水或絨毛細(xì)胞 DNA， 用限制性內(nèi)切酶 Mst II對 DNA酶解 ， 經(jīng)電泳和 Southern吸引轉(zhuǎn)膜后 ， 用放射性標(biāo)記的 β株蛋白基因探針對膜上的 DNA作雜交 ， 根據(jù)經(jīng)放射自顯影后的膠片上雜交斑點(diǎn)的多少和位置可作出診斷： 正常人的 β珠蛋白基因 （ βAβA） 中有 3個(gè) Mst II切點(diǎn) ， 可將該DNA上切成 2個(gè)片段 ， 它們?yōu)? ， 因此會(huì)在相應(yīng)位置產(chǎn)生二條雜交帶；異?；颊叩?β珠蛋白基因 （ βSβS）中 ， 只有 2個(gè)切點(diǎn) ， 可將該 DNA切一條長 。 □ 核移植技術(shù) 將供體復(fù)制對象的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中 。 . 克隆技術(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ) ——細(xì)胞及細(xì)胞的全能性 根據(jù)細(xì)胞學(xué)說，細(xì)胞是一切生物體的結(jié)構(gòu)和功能單位，無論是進(jìn)行有性繁殖還是進(jìn)行無性繁殖的生物，都是有細(xì)胞構(gòu)成的。 采用上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因羊，可從羊奶中提取出治療心臟病的藥物 tPA（組織溶解酶原激活劑）。 TDNA Tumor production Nopaline synthesis TDNA transfer function Nopaline utilization Origin of replication Ti plasmid Ti質(zhì)粒（胭脂堿型）簡圖 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 2. 農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒作為植物基因工程載體 科學(xué)家根據(jù)冠癭瘤形成的分子機(jī)理，通過改建農(nóng)桿菌 Ti質(zhì)粒，使 Ti質(zhì)粒中的致瘤基因失活，同時(shí)插入目的基因，使之成為基因工程載體。 通常 ， 每一后續(xù)時(shí)期基因的表達(dá)水平都高于前一時(shí)期基因表達(dá)的水平 ， 其中極晚期基因表達(dá)水平顯著提高 ， 這也是構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ) 。 表達(dá)產(chǎn)物的 Westernblot鑒定結(jié)果顯示：該表達(dá)蛋白可與豚鼠抗人 F 蛋白的抗血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) ， 在硝酸纖維素膜上呈現(xiàn)一條分子量為 43kD的顯色帶 （ ） SDSPAGE and Westernblot of the expressed F Antigen (A) molecular weight standard。 一、利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物 利用基因工程技術(shù)不但能得到大量的具有特殊功能的基因。在 重組 DNA 技術(shù)中常需研究 DNA 序列上特定部位的功能，或改變 基因編碼區(qū)個(gè)別氨基酸的密碼子以提高該基因表達(dá)蛋白質(zhì)活性 等。 非選擇性地在細(xì)菌中克隆一個(gè)高等生物的隨機(jī) DNA片段的方法稱為鳥槍法 （ Shotgunning） ，全部克隆的集合體稱為一個(gè)基因文庫 （ gene bank, or gene library） 。 （ 2） 分子中具有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn) ， 能使載體自身和插入的外源 DNA共同復(fù)制 。 （ 2） 在限制性內(nèi)切酶和連接酶的作用下 ， 將目的基因與克隆載體相連接 ， 組成一個(gè)新的重組 DNA分子 （ rebinant DNA （ 3） 將重組 DNA分子引入受體細(xì)胞 ， 并在細(xì)胞中進(jìn)行 DNA復(fù)制 ， 最常用的受體細(xì)胞為大腸桿菌 。 Bacterium A has the capacity to modify DNA whereas B does not 三 、 限制酶的特異性 1970年 ， Hamilton Smith從流感嗜血桿菌 d株分離到能識(shí)別特定核苷酸序列 ， 切點(diǎn)專一的限制酶－ HindII ↓ 5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’ 3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’ ↑ Smith進(jìn)一步證明宿主誘導(dǎo)的甲基化作用保護(hù)了具有同樣序列的 DNA免受 HindII的切割： ↓ m 5’－ G－ T－ Py－ Pu－ A－ C－ 3’ 3’－ C－ A－ Pu－ Py－ T－ G－ 5’ m ↑ * * Py： pyrimidine Pu： purine R質(zhì)粒的一個(gè)基因產(chǎn)生的限制酶 EcoRI， 它對 SV40病毒的環(huán)狀 DNA分子上只有一個(gè)切點(diǎn) 。 組蛋白是與核 DNA結(jié)合的堿性蛋白 ， 富含精氨酸 ， 其編碼區(qū)相對富含 G－ C對 。 從正向和反向閱讀是同一句子： ABLE WAS I ERE I SAW ELBA 幾種限制酶的名稱和識(shí)別序列 T↓C T A G A A G A T C↑T Xba I C T G C A↓G G↑A C G T C Pst I A↓A G C T T T T C G A↑A Hind III G A T↓A T C C T A↑ T A G EcoR V G↓A A T T C C T T A A↑G EcoR I G↓G A T C C C C T A G↑G Bam H I 識(shí)別位點(diǎn)序列 內(nèi)切酶 四 、 限制酶作圖 1． 在 DNA分子上確定限制酶切點(diǎn)的相對順序是一種重要的染色體作圖法 。 （ 2） 以 mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的 DNA， 稱 cDNA， 并構(gòu)建 cDNA克隆 。 當(dāng)外源基因插入到多克隆位點(diǎn)區(qū)后就阻斷了 Lac Z基因的編碼區(qū)，使 Lac Z基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這些細(xì)胞就不能利用 Xgal，結(jié)果在培養(yǎng)基上形成 白色的菌落。 2． Southern Blotting 酶切和電泳只能對重組克隆作出初步鑒定，可得知克隆片段的大小但尚難確定克隆片段是否目的基因。 為此 Sanger第二次獲得諾貝爾獎(jiǎng) 。 □ 胰島素是治療糖尿病的重要藥物 ， 之前從豬或牛的胰腺中提取分離 ， 含量少而且會(huì)有毒素 。 induced by IPTG。通過重組病毒空斑純化得到能表達(dá)外源基因的重組病毒。 葉片用抗乙肝病毒表面抗原的抗體處理的結(jié)果。 由于人和老鼠的基因非常接近，因此當(dāng)懷疑人類基因圖譜中的某一片段同某種疾病相關(guān)時(shí)，就將老鼠體內(nèi)的這個(gè)基因去除掉，看它會(huì)長成什么樣。 例如植物體的每個(gè)細(xì)胞都具有在離體條件下誘導(dǎo)分化形成完整植株的能力 ， 這是由于每個(gè)細(xì)胞都具有完整基因組實(shí)現(xiàn)的 。 是全世界注目的焦點(diǎn) ， 有人設(shè)計(jì)了克隆人的技術(shù)路線 動(dòng)物克隆中急待解決的問題 低 (13%) 化是影響克隆胚胎發(fā)育的重要因素 . : 發(fā)現(xiàn)有些克隆動(dòng)物的線粒體 (mtDNA)為雜合體 ,既有受體胞質(zhì)的 ,也有供體細(xì)胞來的 . ： 正常細(xì)胞沒有端粒酶，所以端粒會(huì)隨著細(xì)胞分裂而變短，細(xì)胞衰老。 Genotype determination using allelespecific oligonucleotides (ASOs). 197 3. PCR檢測法 用 Southern雜交法對鐮形細(xì)胞貧血癥作產(chǎn)前診斷需要足夠的細(xì)胞， 并需提取純化 DNA， 并作酶切和雜交等步驟 ， 不但所需時(shí)間較長 ， 而且有一定的風(fēng)險(xiǎn) 。 遺 傳 疾 病 的 分 類 （一）染色體病 （二）單基因遺傳病 （三）多基因遺傳病 遺傳病的發(fā)病率有增高趨勢 ? 1956年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 4‰ ； ? 1968年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 6‰ ； ? 1977年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 ‰ ； 遺傳病本身具有的嚴(yán)重性 ? 遺傳性 (hereditary): 患者家庭的上、下垂直發(fā)病或同代間的水平發(fā)病， 家系中往往有多個(gè)發(fā)病的個(gè)體； ? 先天性 (inborn): 在胎兒期即存在遺傳損害，生后即出現(xiàn)缺陷，給預(yù)防和治療造成極大的困難； ? 終生性 (life long): 患者受累終生直至死亡 （ AR） （ AR） （ AR） （ AD） （ XR） （線粒體?。? 遺傳服務(wù)中應(yīng)遵循的倫理學(xué)原則 遺傳服務(wù)的四大倫理原則 ? 尊 重 自 主 ? 行 善 ? 無 傷 害 ? 公 正 產(chǎn)前診斷中涉及道德問題上的 4項(xiàng)基本準(zhǔn)則 ? 尊重夫婦雙方的選擇 ? 對個(gè)人和家庭不產(chǎn)生傷害 ? 產(chǎn)前診斷的結(jié)果可靠 ? 產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢的自愿性 二、基因治療（ gene therapy） 人類的遺傳性疾病治療的常規(guī)方法： （ 1） 手術(shù)治療 ， 如先天性心臟病通過手術(shù)加以矯正 .（ 2）藥物治療 ， 如生長激素缺乏癥 （ 侏儒 ） 可注射人生長激素等 。 Gene therapy for treatment of severe bined immunodeficiency (SCID), a fatal disorder of the immune system caused by absence of the enzyme adenosine deaminase (ADA) Ashanti DiSilva, the first person to be treated by gene therapy. 第八節(jié) 基因工程生物技術(shù)和社會(huì)倫理問題 由于生物技術(shù)與人類社會(huì)的密切聯(lián)系，所以引起的爭論也十分強(qiáng)烈。 (2)． 將患者的體細(xì)胞 （ 稱靶細(xì)胞 ） 作體外培養(yǎng) ， 常用的有 T淋巴細(xì)胞 ， 骨髓干細(xì)胞 ， 皮膚成纖維細(xì)胞 、 肌細(xì)胞 、 肝細(xì)胞等 (3)． 外源基因的轉(zhuǎn)移 ， 將外源基因通過載體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中 ， 常用轉(zhuǎn)染的方法 （ 加入磷酸鈣 ） 導(dǎo)入到細(xì)胞中 ， 并與細(xì)胞中核 DNA整合到一起 ， 也可用重組病毒感染靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移外源基因 。 每一周期可使目的基因擴(kuò)增一倍 ， 經(jīng) 30個(gè)周期可擴(kuò)增 230目的基因片段 。 □ 人類遺傳性 疾病的產(chǎn)前診斷 人類有 200多種遺傳病可用基因診斷技術(shù)作出準(zhǔn)確的診斷，甚至在發(fā)病前和出生前作出診斷。 1962年 Gurdon 用成年蛙體細(xì)胞克隆出青蛙， 1965年童第周完成了金魚的核移植成功。 基因敲除的應(yīng)用領(lǐng)域主要有： 建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機(jī)理、分子基礎(chǔ)及診斷治療的重要實(shí)驗(yàn)材料。 5． 轉(zhuǎn)基因植株的遺傳 以孟德爾比例傳遞 。 與野生型病毒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞 用磷酸鈣沉淀法將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1393hGH與野生型病毒 AcMNPV DNA共轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的