【正文】 Sf9細(xì)胞，由于pVL1393多角體啟動(dòng)子兩側(cè)存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒 rAcVhGH 。 苜蓿尺蠖核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV)作為桿狀病毒 昆蟲細(xì)胞真核基因表達(dá)系統(tǒng)的載體被廣泛應(yīng)用。 提取大鼠肝臟總 RNA，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR（ RTPCR）擴(kuò)增出目的基因（ Fantigen’s cDNA），然后將其與 pET15b載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。 如在加有 ddATP的反應(yīng)管中產(chǎn)生的是一系列以 A為結(jié)尾的寡核苷酸鏈；在加有 ddGTP的反應(yīng)管中形成的是以 G為結(jié)尾一組寡核苷酸鏈等等 ， 再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 轉(zhuǎn)膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出 DNA序列 。 * 一個(gè)基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別 ， 為什么 ？ 4． 直接分析克隆基因表達(dá)的蛋白 在生物的不同器官和組織，或在細(xì)胞的不同的分化階段會(huì)有某些特定基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞中的特定基因會(huì)特異性轉(zhuǎn)錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉(zhuǎn)錄方法獲得該基因的cDNA。 分離這種復(fù)制型的雙鏈可用作克隆的載體 。 一 、 直接產(chǎn)生粘性末端用于組成一個(gè)新的重組DNA分子 （ rebinant DNA） 162 二 、 加尾連接 （ Tailing） 1． 同聚物加尾 末端轉(zhuǎn)移酶 （ terminal transferase） 能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾 ， 如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端 ， 就可以連接成重組質(zhì)粒 ， polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。如用上述兩酶混合消化獲得 、 。細(xì)菌的基因型決定該細(xì)菌對(duì)各種噬菌體感染的敏感性， 一種噬菌體的基因型決定它所能感染細(xì)菌的范圍 ，它們之間具有密切的依賴和限止關(guān)系 。 In situ hybridization of human metaphase chromosomes using fluorescent technique (FISH) 第二節(jié) 限制性內(nèi)切酶 一 、 宿主限制現(xiàn)象 X X A B XA XB A B A B XA XB XA XB 100% 100% % 100% Phage Infect Bacteria 從兩個(gè)不同菌株 A和 B來的噬菌體 X具有不同的感染能力 XA A XA B XB A XA 100% 100% 很差 無法分離到能感染 A細(xì)菌的 XB來的噬菌體 用很少一些感染力差的 結(jié)果說明： 噬菌體的宿主范圍取決于它所來源的細(xì)菌菌株 ， 而不是噬菌體的基因型； 宿主的基因型對(duì)噬菌體有一種修飾作用 ， 但并不改變噬菌體 DNA的序列 。如用 Hind Ⅲ 消化獲得 和 。組成一個(gè)生物的基因文庫的全部重組質(zhì)粒或重組噬菌體中的目的基因就代表了一個(gè)生物的整個(gè)基因組。 3． 單鏈病毒 在感染 ， 感染性單鏈能轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型 。 用反轉(zhuǎn)譯酶從 mRNA制備 cDNA， 全部 cDNA片段與質(zhì)粒載體相連 ， 轉(zhuǎn)化 cDNA文庫 。 如下圖： aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑ ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA 175 189 445 aa1 aa2 3 4 89 90 ↓ 基因 E開始 基因 E終止 ↑ 基因 D開始 基因 D終止 Sanger序列分析方法原理 采用單鏈 DNA（ 或?qū)⒑型庠椿虻闹亟M質(zhì)粒 DNA變性 ） ， 在引物和 DNA聚合酶的作用下 ， 在四組獨(dú)立的反應(yīng)中除加有 4種 dNTPs外 （ 其中之一為同位素標(biāo)記 ） ， 再分別加入 4種 ddNTPs中的一種作為鏈延伸的終止劑 ， 結(jié)果將在四組反應(yīng)管中產(chǎn)生長度不等的 4組寡核苷酸鏈 ， 它們分別終止于被測(cè)鏈的每一個(gè) A、 G、 C或 T。 方法： 基因克隆。 幾種重要的基因工程藥物已可用真核細(xì)胞反應(yīng)器完成 治療癌癥抗病毒 預(yù)防病毒性肝炎 治療血友病 治療貧血癥 治療心臟病 促生長，增強(qiáng)免疫功能 酵母菌 酵母菌 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 昆蟲細(xì)胞 α干擾素 乙肝疫苗 集落刺激因子 紅細(xì)胞生成素 組織溶纖酶原激活劑 人生長激素 應(yīng) 用 細(xì) 胞 名 稱 昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (Insect cell and Baculovirus Expression System) 是一種高效的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 桿狀病毒因其病毒粒子呈棒狀或桿狀而得名。 用重組病毒感染宿主細(xì)胞 ， 感染后期得到外源基因的高效表達(dá) 。 轉(zhuǎn)基因西紅柿的途徑 5． 植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法 （ 1） 葉圓片共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 （ 2） 單細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)化 在 Kan培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的組織 ——再生植株 。既可以是用突變基因敲除相應(yīng)的正?；?，也可以用正?；蚯贸鄳?yīng)的突變基因。 關(guān)鍵的問題是：動(dòng)物細(xì)胞的分化過程是不可逆的嗎？ 1. 動(dòng)物克隆的早期設(shè)想： 1938年，德國胚胎學(xué)家 Hans Spemann提出了用成年體細(xì)胞的核移植到未受精的卵細(xì)胞中，來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無性繁殖，未成功 2. 從低等動(dòng)物開始，兩棲類和魚類 1952年 Robert Briggs和 Thomas J King用囊胚核移植方法產(chǎn)生了蝌蚪，未生成青蛙。如 HIV的 DNA序列已經(jīng)搞清，可以根據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成一段引物，再從受檢人的血液或組織中抽提極微量的 DNA為模板進(jìn)行 DNA的擴(kuò)增，如獲得與 HIV DNA序列相同的特定長度的DNA片段，即可確定受檢者攜帶 HIV病毒。 （ 3） 鏈延伸：在 72℃ ， 以單鏈為模板 ， 在引物的 3’末端以互補(bǔ)原則合成新鏈 。 1. 基因治療方法和步驟 (1)．通常將正常的基因首先與基因轉(zhuǎn)移的載體相連接， 常采用的載體有 反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體 。 “巨大的力量意味著重大的責(zé)任” ——美國總統(tǒng)生命倫理咨詢委員會(huì) 伯格會(huì)議和 HGP的啟示 美國斯坦福大學(xué)教授 1975 伯格會(huì)議 是否可暫停基因重組實(shí)驗(yàn)，先著手制定共同遵循的規(guī)范 伯格會(huì)議和 HGP的啟示 人類基因組計(jì)劃 （ HGP） 相關(guān)倫理、法律和社會(huì)影響的研究 （ ELSI） 生命科學(xué)史乃至全部科學(xué)技術(shù)史上的第一次 600萬猶太亡靈的呼喚 信奉優(yōu)生學(xué)的科學(xué)家把 《 人類遺傳學(xué) 和種族衛(wèi)生概念 》 等狂熱鼓吹人類不 平等的優(yōu)生學(xué)著作送給希特勒，成為 他推行種族屠殺政策的重要“科學(xué)”依據(jù) 日本 731部隊(duì)的細(xì)菌武器試驗(yàn) 731部隊(duì)遺址 從 1933年至 1945年， 731部 隊(duì)等一直在進(jìn)行人體細(xì)菌武 器試驗(yàn)。 □ 基因治療定義 ： 應(yīng)用基因工程手段用正?；?qū)牖蛴腥毕莸陌屑?xì)胞中 ， 使正常基因表達(dá) ， 并合成相應(yīng)的產(chǎn)物 ， 使細(xì)胞恢復(fù)正常的功能 ， 使疾病得到治療 。 PCR法：根據(jù) β珠蛋白基因序列設(shè)計(jì)二條引物；取得極微量胎兒絨毛細(xì)胞或患者血液，裂介細(xì)胞粗提 DNA，然后作 PCR擴(kuò)增，無論是正?；虍惓Ｕ叨紩?huì)產(chǎn)生 DNA片段。那么 克隆動(dòng)物是否會(huì)隨著供體細(xì)胞的縮短的端粒而提前衰老呢？ 有發(fā)現(xiàn) Dolly 羊的端粒限制性片段平均長度（ mean terminal restriction fragment,TRF) 比同齡對(duì)照短。 植物細(xì)胞全能性實(shí)驗(yàn)的重要事件： 1. Steward， 1958， 從胡羅卜根游離單細(xì)胞培養(yǎng)成完整植株 。 如果沒眼，那么被去除的基因就是決定長眼的基因。 正常 葉片 4. 具有易于長期保鮮的轉(zhuǎn)基因西紅柿的制作過程原理如下： 通常的西紅柿不易保存保鮮，這是由于一種蛋白酶的催化成熟的結(jié)果。 Transfer vecter Pp Cloned gene Pt 5, 3, Polyhedrin gene AcMNPV DNA Rebinant AcMNPV Fig. 共轉(zhuǎn)染發(fā)生同源重組獲得重組病毒 野生型病毒感染的昆蟲細(xì)胞由于存在多角體基因 ， 空斑測(cè)定時(shí)產(chǎn)生有多角體的空斑（ occ+） 。 induced by IPTG。 □ 人生長激素是治療侏儒癥 ， 青少年增高和促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù)的藥物 ， 生長激素具有種屬特異性 ， 從動(dòng)物腦組織來源的生長激素不能用于人類 ， 之前只能從剛死亡的人大腦垂體中分離純化 ， 來源極有限；而且發(fā)現(xiàn)長期應(yīng)用會(huì)對(duì)人類有毒副作用 。 發(fā)現(xiàn)了重疊基因 Sanger等最早對(duì) Φ 174病毒作 DNA序列分析 ， 該病毒基因組全長 5400bp， 共編碼 9種蛋白質(zhì) ， 但根據(jù)該 9種蛋白質(zhì)分子量推算其編碼區(qū) ， 明顯超過病毒基因組5400bp長的核苷酸所能編碼的容量 。 Southern發(fā)明了一種對(duì)電泳凝膠中的 DNA作分子雜交鑒定的方法。 挑選出白色菌落可作進(jìn)一步鑒定。 （ 3） 采用聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） 特異性地?cái)U(kuò)增某一目的基因的片段 。 從圖上任何兩個(gè)切點(diǎn)之間的距離可估計(jì)出核苷酸的數(shù)目 。 海膽組蛋白基因在較底溫度時(shí)（ 61℃ ）的變性電鏡圖，每種組蛋白基因被一個(gè)富含 A－ T對(duì)區(qū)域間隔開。 ?在宿主限制現(xiàn)象中有兩個(gè)相互的過程： （ 1） 由于宿主核酸酶的作用破壞了侵入的噬菌體 DNA， 從而 限制 了噬菌體的繁殖； （ 2） 噬菌體 DNA修飾 免除了限制酶的作用 。 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 （ 1） 獲得目的基因 ， 一般是有重要生物學(xué)功能的外源基因 。 EcoRI ↓ C C G A A T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接頭 ↑ EcoRI ＋ T4DAN 連接酶 人工接頭 EcoRI 外源 DNA 粘性末端用于連接載體 人工接頭的應(yīng)用 四 、 載體 Vectors 能使克隆的片段不斷復(fù)制的一類 DNA分子稱載體 ， 應(yīng)具備以下特點(diǎn)： （ 1） 分子量小 ， 核苷酸序列清楚 ， 具有一些單一酶切位點(diǎn)或人工插入的多克隆位點(diǎn)區(qū) 。 Shuttle Vectors 第四節(jié) 重組 DNA方法學(xué) 一 、 克隆戰(zhàn)略 1． 無選擇地從一個(gè)限制酶切