【正文】 個(gè)基因組。 （ 3） 采用聚合酶鏈反應(yīng) （ PCR） 特異性地?cái)U(kuò)增某一目的基因的片段 。 大量培養(yǎng)細(xì)胞可獲得目的基因的大量拷貝，或基因表達(dá)的產(chǎn)物等。 第三節(jié) 重組 DNA ? 在細(xì)菌細(xì)胞中選擇性地?cái)U(kuò)增特定DNA 片 段 的 過(guò) 程 稱 分 子 克 ?。?molecular cloning） 。如用 Hind Ⅲ 消化獲得 和 。 從圖上任何兩個(gè)切點(diǎn)之間的距離可估計(jì)出核苷酸的數(shù)目 。 由于切點(diǎn)是錯(cuò)開(kāi)的 ， 因此使 SV40的環(huán)狀分子切開(kāi)成具有 粘性末端 （ sticky ends） 的線狀分子 。 如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一個(gè)甲基后就能保護(hù) DNA免受核酸酶的攻擊 ， 該過(guò)程稱 甲基化作用 （ methylation） 。 In situ hybridization of human metaphase chromosomes using fluorescent technique (FISH) 第二節(jié) 限制性內(nèi)切酶 一 、 宿主限制現(xiàn)象 X X A B XA XB A B A B XA XB XA XB 100% 100% % 100% Phage Infect Bacteria 從兩個(gè)不同菌株 A和 B來(lái)的噬菌體 X具有不同的感染能力 XA A XA B XB A XA 100% 100% 很差 無(wú)法分離到能感染 A細(xì)菌的 XB來(lái)的噬菌體 用很少一些感染力差的 結(jié)果說(shuō)明： 噬菌體的宿主范圍取決于它所來(lái)源的細(xì)菌菌株 ， 而不是噬菌體的基因型； 宿主的基因型對(duì)噬菌體有一種修飾作用 ， 但并不改變噬菌體 DNA的序列 。 海膽組蛋白基因在較底溫度時(shí)（ 61℃ ）的變性電鏡圖，每種組蛋白基因被一個(gè)富含 A－ T對(duì)區(qū)域間隔開(kāi)。第四章 基因操作 Gene manipulation 第一節(jié) 堿基互補(bǔ)的能力 一 、 DNA的熱變性 1． G－ C含量高的 DNA具有較高的熔解溫度 ， 可以根據(jù)熔解溫度的不同將 GC含量不同的 DNA分子分開(kāi) ， 并可推測(cè) DNA分子中 G－ C的相對(duì)含量 。用 S1核酸酶處理，消除單鏈。細(xì)菌的基因型決定該細(xì)菌對(duì)各種噬菌體感染的敏感性， 一種噬菌體的基因型決定它所能感染細(xì)菌的范圍 ，它們之間具有密切的依賴和限止關(guān)系 。 ?在宿主限制現(xiàn)象中有兩個(gè)相互的過(guò)程： （ 1） 由于宿主核酸酶的作用破壞了侵入的噬菌體 DNA， 從而 限制 了噬菌體的繁殖； （ 2） 噬菌體 DNA修飾 免除了限制酶的作用 。 上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保護(hù) DNA免受 EcoRI的切割 。 2． 方法要點(diǎn)：特定來(lái)源的 DNA經(jīng)不同的酶消化后 ， 樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 ， 可得到限制位點(diǎn)的圖譜 。如用上述兩酶混合消化獲得 、 。 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 （ 1） 獲得目的基因 ， 一般是有重要生物學(xué)功能的外源基因 。 一般意義上的重組DNA技術(shù)專指在細(xì)菌細(xì)胞中特異性地?cái)U(kuò)增特定 DNA片段的分子克隆技術(shù)，廣義上的重組 DNA技術(shù)還延伸到整個(gè)基因工程的應(yīng)用領(lǐng)域 。 細(xì)胞內(nèi)總 DNA的提取和基因文庫(kù)的構(gòu)建 各種生物的特定組織 （ 如血液 、 肝臟 、 植物組織 、 細(xì)菌細(xì)胞等 ）都含有大分子量的 DNA。 一 、 直接產(chǎn)生粘性末端用于組成一個(gè)新的重組DNA分子 （ rebinant DNA） 162 二 、 加尾連接 （ Tailing） 1． 同聚物加尾 末端轉(zhuǎn)移酶 （ terminal transferase） 能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾 ， 如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端 ， 就可以連接成重組質(zhì)粒 ， polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。 EcoRI ↓ C C G A A T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接頭 ↑ EcoRI ＋ T4DAN 連接酶 人工接頭 EcoRI 外源 DNA 粘性末端用于連接載體 人工接頭的應(yīng)用 四 、 載體 Vectors 能使克隆的片段不斷復(fù)制的一類 DNA分子稱載體 ， 應(yīng)具備以下特點(diǎn)： （ 1） 分子量小 ， 核苷酸序列清楚 ， 具有一些單一酶切位點(diǎn)或人工插入的多克隆位點(diǎn)區(qū) 。 A colorenhanced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium . .The plasmid pUC18 offers several advantages as a vactor for cloning Cloning with a plasmid vector. 169 利用 Lac Z基因的插入失活篩選重組子 許多載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入在Lac Z基因區(qū)中。 A Petri plate showing the growth of bacterial cells after uptake of rebinant plasmids. 166 菌落原位雜交篩選和鑒定克隆的基因 根據(jù)重組質(zhì)粒中的目的基因的序列，合成一段與之互補(bǔ)的 DNA序列，并使其標(biāo)記上放射性同位素，該段 DNA稱為探針。 分離這種復(fù)制型的雙鏈可用作克隆的載體 。 Shuttle Vectors 第四節(jié) 重組 DNA方法學(xué) 一 、 克隆戰(zhàn)略 1． 無(wú)選擇地從一個(gè)限制酶切的混合物中克隆全部片段 ， 然后再篩選所需的目的基因 。 組成一個(gè)基因文庫(kù)的全部重組質(zhì)?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組。該方法可用于重組質(zhì)粒鑒定，轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的插入位置，遺傳病的分子診斷等。 * 一個(gè)基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別 ， 為什么 ？ 4． 直接分析克隆基因表達(dá)的蛋白 在生物的不同器官和組織，或在細(xì)胞的不同的分化階段會(huì)有某些特定基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞中的特定基因會(huì)特異性轉(zhuǎn)錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉(zhuǎn)錄方法獲得該基因的cDNA。 三，克隆基因的定點(diǎn)誘變 □ 意義 ：基因的功能通常是通過(guò)其突變體來(lái)認(rèn)識(shí)其作用的。 思考：如何用分子雜交法 篩選和 鑒定一個(gè)野生型和一個(gè)突變型基因？ 第五節(jié) DNA序列分析 DNA序列分析是最終了解基因結(jié)構(gòu)和組成的重要工具 ,在人類基因組計(jì)劃中測(cè)定人基因組的全部核苷酸序列是該計(jì)劃的核心 。 如何解開(kāi)這個(gè)謎 ？ Sanger回答了這個(gè)問(wèn)題： 在基因組中存在重疊基因 ！ 重疊基因 定義：在一種蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列中包含了另一種蛋白質(zhì)的編碼序列，所不同的是各自以不同的讀碼框轉(zhuǎn)譯。 如在加有 ddATP的反應(yīng)管中產(chǎn)生的是一系列以 A為結(jié)尾的寡核苷酸鏈；在加有 ddGTP的反應(yīng)管中形成的是以 G為結(jié)尾一組寡核苷酸鏈等等 ， 再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 轉(zhuǎn)膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出 DNA序列 。 基因工程 □ 定義：根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì) DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 目前有幾十種基因工程藥物 ， 常用的有：干擾素 、 白細(xì)胞介素 、 乙肝疫苗 、 人胰島素和人生長(zhǎng)激素等 。 The method used to synthesize rebinant human insulin. 1915 溴化氰 例子 大鼠肝臟 F抗原 蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá) F蛋白定位在肝細(xì)胞漿中 ， 正常人肝組織中的 F蛋白含量是血清中 1370倍 ， 只有肝細(xì)胞被破壞時(shí) ， F抗原才釋放到血漿中 ， 使血清中 F抗原含量升高 ， F抗原用作肝病診斷 ， 首先需獲得純的 F抗原 。 提取大鼠肝臟總 RNA，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR（ RTPCR）擴(kuò)增出目的基因（ Fantigen’s cDNA），然后將其與 pET15b載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。 F抗原純化與鑒定 離心后所得包涵體蛋白經(jīng)過(guò)初步純化和溶解后 ， 經(jīng)過(guò)親和層析柱 （ Ni2+charged IDA Hisbind column） 純化 ， 得到一分子量約為43kD的單一蛋白帶 （ 8） 。 of the lysate。 target protein (B) Westernblot of the purified target protein. Guinea pig polyclonal antiserum against human F antigen was used as primary antibody. (A) 1 2 3 4 5 6 7 8 (B) 二、用真核細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)基因工程藥物 雖然用大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)基因工程藥具有許多優(yōu)點(diǎn) ， 如成本低等 ， 但由于原核系統(tǒng)表達(dá)的真核基因蛋白有時(shí)缺乏生物活性 ， 其原因由于原核生物缺乏合適的轉(zhuǎn)譯后修飾機(jī)制 。 苜蓿尺蠖核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV)作為桿狀病毒 昆蟲(chóng)細(xì)胞真核基因表達(dá)系統(tǒng)的載體被廣泛應(yīng)用。 多角體包含體的組成 ?桿狀病毒基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)式時(shí)序調(diào)控 桿狀病毒的基因表達(dá)分為 4個(gè)時(shí)期：極早期（ immediateearly, α） 、 晚早期 (delayedearly,β)、晚期 (late, γ)和極晚期 (very late, δ)。 由于這兩個(gè)特點(diǎn) ， 使人們得以設(shè)計(jì)利用桿狀病毒啟動(dòng)子在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源基因 . 桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建 由于 AcMNPV基因組的巨大 ， 不可能用單一的限制性酶來(lái)對(duì)它進(jìn)行操作 ， 所以目前使用的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體 （ transfer vector）的方法 。 重組后由于多角體蛋白基因已被外源基因所取代 ， 只能產(chǎn)生無(wú)多角體的空斑（ occ） 。 與野生型病毒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞 用磷酸鈣沉淀法將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1393hGH與野生型病毒 AcMNPV DNA共轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的 Sf9細(xì)胞，由于pVL1393多角體啟動(dòng)子兩側(cè)存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長(zhǎng)激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒 rAcVhGH 。 Ti質(zhì)粒上的一段 DNA能轉(zhuǎn)移到侵染的植物部位細(xì)胞中，并插入到植物染色體中，由于該片段（稱 TDNA）上具有誘發(fā)腫瘤的基因，所以能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。 草甘膦能被植物細(xì)胞的葉綠體的酶（EPSP合成酶 ）所分解，該酶對(duì)細(xì)菌和植物中的氨基酸的合成很重要，沒(méi)有這種酶的作用，植物就會(huì)干枯和死亡。將這種酶的基因分離出來(lái)，再根據(jù)該基因序列結(jié)構(gòu)合成它的互補(bǔ)基因，再將