【正文】 經(jīng) 56個(gè)月的基因治療 ， 患者體內(nèi) T淋巴細(xì)胞的數(shù)量恢復(fù)到正常水平 ， 體內(nèi) ADA酶幾乎達(dá)到正常水平 ， 免疫功能得到恢復(fù) 。 (4)． 對(duì)能正常表達(dá)目的基因的靶細(xì)胞作檢定后回輸?shù)交颊唧w內(nèi) 。 Gene screening using a DNA microarray. 遺傳咨詢的若干倫理問題 遺 傳 病 的 定 義 遺傳病是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生改變而造成的疾病，它可在上下代之間按一定的方式垂直傳遞，并且在有血緣關(guān)系的個(gè)體間由于遺傳繼承，有一定的發(fā)病比例。 PCR技術(shù)是 DNA操作的重大發(fā)明 ， Mullis等獲得了 1993年諾貝爾獎(jiǎng) 。 在較高溫度時(shí) ， 互補(bǔ)序列才能雜交 ， 只有一個(gè)錯(cuò)配堿基的 DNA也不能雜交 。如胎兒的羊水和胎盤絨毛細(xì)胞可從母體內(nèi)取得，取出的細(xì)胞可以進(jìn)行染色體核型、性別、生化和基因組缺陷的檢測 1． 檢測限制性位點(diǎn)的變化 （ 1） 鐮形細(xì)胞貧血癥是編碼血紅蛋白 β鏈的一個(gè)決定谷氨酸的密碼子 GAG變成了編碼纈氨酸的密碼子 GTG， 從而使血紅蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生根本的改變 ， 該患者的紅細(xì)胞由正常的園盤形變成鐮刀形 。 。 Steen Willadsen 成功利用胚胎細(xì)胞的細(xì)胞核移植到未受精的卵細(xì)胞中產(chǎn)生了一頭綿羊，后來有小鼠，兔，山羊，牛，豬等克隆成功。 細(xì)胞全能性 （ Cell totipotency） ：任何一個(gè)處于細(xì)胞分化臨界期之前的細(xì)胞 ， 只要處于合適的條件即可以發(fā)育為完整的生物體 ， 也可以發(fā)育成任何組織或器官等 。 改造動(dòng)物基因型 ， 研究基因敲除小鼠在胚胎發(fā)育及生命各期的表現(xiàn)，可以得到該基因在生長發(fā)育中的作用，為研究基因的功能和生物效應(yīng)提供模式。 基因剔除技術(shù) 研究人類基因功能的重要手段是 基因敲除。 轉(zhuǎn)基因植株的一對(duì)染色體 Kan 自交 1/4 Kans 1/2 Kanr 1/4Kanr 思考 題 ： Kanr 能在轉(zhuǎn)基因植株中以組成型的方式表達(dá) ， 如對(duì)轉(zhuǎn)化植株的花藥作培養(yǎng)所得花粉植株抗性和敏感性比例如何 ？ 轉(zhuǎn)化植株自交或與野生型回交的結(jié)果如何 ？ 四 .轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 :轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入外源基因 ,并在其基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物 . : (1).建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型以研究外源基因在整體動(dòng)物中的表達(dá)調(diào)控規(guī)律 。 從抗草甘膦的細(xì)菌中分離和克隆 EPSP合成酶的基因和抗除草劑基因工程 抗除草劑基因工程示意圖 首先從抗草甘膦的細(xì)菌中分離和克隆EPSP合成酶基因，再進(jìn)行植物抗除草劑基因工程 Gene transfer of glyphosate resistance Tobacco leaves expressing the hepatitis B antigen. 轉(zhuǎn)基因植物葉片表達(dá)乙肝病毒表面抗原。 重組病毒的 Southern 雜交鑒定 ， hGH cDNA整合 進(jìn)桿狀病毒基因組的正確位置中 表達(dá)產(chǎn)物的 SDSPAGE與 Westernblot分析 三、植物基因工程 □ 定義： 將外源目的基因?qū)塍w外培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞，通過組織或細(xì)胞培養(yǎng)使之發(fā)育成完整的再生植株 ——轉(zhuǎn)基因植株。 將帶有外源基因的轉(zhuǎn)移載體 DNA和野生型病毒 DNA共轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，使得轉(zhuǎn)移載體與野生型病毒發(fā)生同源重組，外源基因取代多角體基因， 如 Fig所示。 1. 幼蟲吞食了感染有多角體的食物 ,多角體在消化道的堿性環(huán)境下溶解，釋放出病毒顆粒， 2. 每個(gè)病毒顆粒的脂蛋白外被又與腸壁細(xì)胞的質(zhì)膜相融合，最終將核殼體釋放至胞質(zhì)中，核殼體再將自己的 DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)。 noninduced by IPTG。將酶切結(jié)果正確的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET15bF。 人類最早的商業(yè)化基因工程藥物是 人胰島素和人生長激素， 于 80年代初投放市場 ， 用大腸桿菌來生產(chǎn) ， 是 基因工程 發(fā)展的里程碑 。 O Base H H O = P – P – P – O O O O O O O 2’、 3’ddNTP的結(jié)構(gòu)，注意其 3’位置是一個(gè) H而不是 OH，因此后續(xù)的脫氧核苷酸不能接到 3’位上 從 而造成鏈的終止。 1977年 Sanger發(fā)明了以雙脫氧核苷三磷酸 （ 2’3’ddNTPs） 作為 DNA合成終止劑的 “ 末端終止法 ” ， 開創(chuàng)了基因核苷酸序列測定的先河 ， 最早完成了 Φ 174全部序列的測定 。 用反轉(zhuǎn)錄酶從 mRNA合成 cDNA；全部 cDNA片段與載體相連并轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞獲得的全部克隆稱 cDNA 文庫 ， 再從cDNA文庫中調(diào)出目的cDNA克隆 。 二、鑒定克隆的基因 1．用特定的內(nèi)切酶消化重組質(zhì)粒，電泳比較切出片段的大小。 這種噬菌體用作克隆的優(yōu)點(diǎn)：在重新感染合適的宿主時(shí) ， 它產(chǎn)生的噬菌體顆粒是單鏈 DNA，為 DNA序列分析提供方便 。 Lac Z基因編碼β半乳糖苷酶的一個(gè)亞基，它可以使攜帶載體的細(xì)菌在含有 Xgal（能被 β半乳糖苷酶水解的底物）的培養(yǎng)界上形成 藍(lán)色的菌落。 同聚物加尾連接的優(yōu)點(diǎn)：加尾后 DNA片段自身不會(huì)環(huán)化 ，可提高異源 DNA重組率 。 重組 DNA技術(shù)的基本步驟 外源DNA 載體 重組 目的基因的制備 構(gòu)建重組 DNA分子 ， 首先要獲得有用的目的基因片段 ，最常用的方法有三種： （ 1） 直接從一生物中提取基因組 DNA， 并構(gòu)建該基因組的文庫 （ gene library） 再從中調(diào)出目的基因的克隆 。 根據(jù)上述結(jié)果繪制限制性圖譜 。 m m 回文序列 —palindrome ↓ 5’…… G A A T T C …… 3’ 3’…… C T T A A G …… 5’ ↑ EcoRI切點(diǎn)的兩條鏈中的序列從相反方向閱讀是一樣的 ， 稱為回文序列 —palindrome。 在不同基因型的細(xì)菌中生長的噬菌體其具有不同的感染能力 二 、 DNA的修飾 ☆ 是什么限制了 X－ B噬菌體在菌株 A中的繁殖呢 ？ 是由于宿主的一種核酸酶的作用 ， 它能將噬菌體DNA切成許多無感染力的片段 ， 宿主細(xì)胞具有破壞其陌生 DNA的防衛(wèi)系統(tǒng) 。 2． 根據(jù)熔解溫度的差別在 DNA分子中作基因定位和分離基因 。 a b c d e a, b, c, d, e, a b d e a, b, d, e, a b c d e a, b, c, d, e, a b d e a, b, d, e, a b c d e a, b, d, e, Heat Mix and cool 三 、 染色體上 DNA序列的定位 用特異性 RNA或 DNA作探針與染色體上相應(yīng)的 DNA互補(bǔ)區(qū)域作雜交 ， 從而確定該特異性基 因 的 位 置 稱 染 色 體 原 位 雜 交 （ in situ hybridization of chromosome） 。 5’－ G－ A－ A－ T－ T－ C－ 3’ 3’－ C－ T－ T－ A－ A－ G－ 5’ 上述序列是旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的 。 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 D A E B F C 1 2 3 4 5 2 1 2 1 酶切位點(diǎn) 2 1 2 1 酶切圖譜 練習(xí)題： 從某一生物的基因組 Bam HI文庫中獲得了長 ,如用 EcoRI消化該片斷獲得 、 。 （ 4） 對(duì)轉(zhuǎn)化子 （ 含有重組分子的受體細(xì)胞 ） 進(jìn)行篩選和鑒定， 以確認(rèn)含有外源基因 。 非選擇性地在細(xì)菌細(xì)胞中克隆某一生物的隨機(jī) DNA片段的過程稱鳥槍法 ，全部克隆集合體稱某一生物的 基因文庫 。 （ 3） 具有易于篩選重組分子的標(biāo)志 ， 如抗藥性 。 2． λ噬菌體 它的頭部通常能包裝進(jìn) 45kb 長的DNA分子 ， 基因組中間部分是裂解性生長的非必需區(qū) ， 因此在其區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)換插入大的外源 DNA片段可以不影響其復(fù)制功能 。 組成一個(gè)基因文庫的全部重組質(zhì)?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組 。 The Southern blotting technique southern blot after hybridization, exposure, and development. The bands show DNA fragments plementary to the nucleotide sequence of the probe. 3． 用 cDNA克隆作探針 ， 從基因文庫中篩選目的基因克隆 。 □ 定義 :特異性地改變某一基因的方法稱 定點(diǎn)誘變 sitedirected mutagenesis 克隆基因的定點(diǎn)誘變 根據(jù)基因中欲改變位點(diǎn)的核苷酸序列設(shè)計(jì)一段引物，引物中含有突變的堿基。 重疊基因是利用兩種不同的讀碼框架編碼兩種不同的蛋白質(zhì)，在每一讀碼框中密碼子解讀仍是不重疊的。而且可以讓這些特殊功能的基因生產(chǎn)出具有特殊功能的蛋白質(zhì)藥物，這是目前 基因工程 領(lǐng)域中最活躍最有成果和極富商業(yè)價(jià)值的領(lǐng)域之一，究其原因： （ 1）蛋白質(zhì)和多肽是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，可用重組 DNA技術(shù)進(jìn)行研究和生產(chǎn)。 利用原核 （ 大腸桿菌 ） 表達(dá)系統(tǒng) ， 成功表達(dá)了大鼠肝臟 F抗原 ， 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDSPAGE， Westernblot分析 ， 分子量為 43kD， 同時(shí)具有 F抗原的免疫學(xué)活性 ， 可作為一種基因工程產(chǎn)品用于今后的免疫檢測工作 。 induced by IPTG。 □ 真核細(xì)胞反應(yīng)器： 外源基因在合適的載體帶動(dòng)下轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ， 昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞 ， 通過大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)外源基因 。 如 Fig所示 。 由此經(jīng)過幾輪的空斑純化即可獲得多角體缺陷的重組病毒 。通過感染轉(zhuǎn)化植物組織和細(xì)胞，并使之培養(yǎng)成完整的植株。只需用乙烯處理后即可成熟供應(yīng)市場 。 轉(zhuǎn)基因的方法 : 按基因?qū)敕绞絼澐?,建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要有： 顯微注射法 , 反轉(zhuǎn)錄病毒感染法 胚胎干細(xì)胞法 . 顯微注射與反轉(zhuǎn)錄病毒感染方法都是把 DNA直接導(dǎo)入受精卵或在不同的發(fā)育階段 . 受精卵 四細(xì)胞胚胎 囊胚 原腸胚 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 顯微注射 反轉(zhuǎn)錄病毒感染 DNA DNA 在受精卵不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因方法 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用 研究遺傳疾病的基因治療 人類倫理道德一般不允許直接對(duì)人的受精卵進(jìn)行基因操作，一般是將處理過的體細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。 基因敲除還包括引入新基因及引入