【正文】 ral advantages as a vactor for cloning Cloning with a plasmid vector. 169 利用 Lac Z基因的插入失活篩選重組子 許多載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入在Lac Z基因區(qū)中。 分離這種復(fù)制型的雙鏈可用作克隆的載體 。 組成一個(gè)基因文庫(kù)的全部重組質(zhì)?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組。 * 一個(gè)基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別 ， 為什么 ？ 4． 直接分析克隆基因表達(dá)的蛋白 在生物的不同器官和組織，或在細(xì)胞的不同的分化階段會(huì)有某些特定基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞中的特定基因會(huì)特異性轉(zhuǎn)錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉(zhuǎn)錄方法獲得該基因的cDNA。 思考：如何用分子雜交法 篩選和 鑒定一個(gè)野生型和一個(gè)突變型基因？ 第五節(jié) DNA序列分析 DNA序列分析是最終了解基因結(jié)構(gòu)和組成的重要工具 ,在人類(lèi)基因組計(jì)劃中測(cè)定人基因組的全部核苷酸序列是該計(jì)劃的核心 。 如在加有 ddATP的反應(yīng)管中產(chǎn)生的是一系列以 A為結(jié)尾的寡核苷酸鏈；在加有 ddGTP的反應(yīng)管中形成的是以 G為結(jié)尾一組寡核苷酸鏈等等 ， 再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 轉(zhuǎn)膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出 DNA序列 。 目前有幾十種基因工程藥物 ， 常用的有：干擾素 、 白細(xì)胞介素 、 乙肝疫苗 、 人胰島素和人生長(zhǎng)激素等 。 提取大鼠肝臟總 RNA，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR（ RTPCR）擴(kuò)增出目的基因（ Fantigen’s cDNA），然后將其與 pET15b載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。 of the lysate。 苜蓿尺蠖核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV)作為桿狀病毒 昆蟲(chóng)細(xì)胞真核基因表達(dá)系統(tǒng)的載體被廣泛應(yīng)用。 由于這兩個(gè)特點(diǎn) ， 使人們得以設(shè)計(jì)利用桿狀病毒啟動(dòng)子在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)外源基因 . 桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建 由于 AcMNPV基因組的巨大 ， 不可能用單一的限制性酶來(lái)對(duì)它進(jìn)行操作 ， 所以目前使用的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體 （ transfer vector）的方法 。 與野生型病毒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞 用磷酸鈣沉淀法將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pVL1393hGH與野生型病毒 AcMNPV DNA共轉(zhuǎn)染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的 Sf9細(xì)胞，由于pVL1393多角體啟動(dòng)子兩側(cè)存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長(zhǎng)激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒 rAcVhGH 。 草甘膦能被植物細(xì)胞的葉綠體的酶（EPSP合成酶 ）所分解，該酶對(duì)細(xì)菌和植物中的氨基酸的合成很重要，沒(méi)有這種酶的作用，植物就會(huì)干枯和死亡。 5． 轉(zhuǎn)基因植株的遺傳 以孟德?tīng)柋壤齻鬟f 。所以， 通過(guò)培育缺陷性狀得到矯正的動(dòng)物 (或細(xì)胞 ) 可以為這類(lèi)疾病的基因治療提供動(dòng)物 (或細(xì)胞 )模型。 基因敲除的應(yīng)用領(lǐng)域主要有： 建立人類(lèi)疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機(jī)理、分子基礎(chǔ)及診斷治療的重要實(shí)驗(yàn)材料。 根據(jù)細(xì)胞理論 ， 提出高等植物器官和組織可以不斷分割直至單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn) 。 1962年 Gurdon 用成年蛙體細(xì)胞克隆出青蛙， 1965年童第周完成了金魚(yú)的核移植成功。 轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)比轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（通過(guò)原核注射）的方法優(yōu)越：后者整合率和表達(dá)率低，經(jīng)常出現(xiàn)嵌合體。 □ 人類(lèi)遺傳性 疾病的產(chǎn)前診斷 人類(lèi)有 200多種遺傳病可用基因診斷技術(shù)作出準(zhǔn)確的診斷，甚至在發(fā)病前和出生前作出診斷。 因?yàn)橐吧秃屯蛔冃椭徊钜粋€(gè)核苷酸 ， 都可能與正常野生型探針雜交 。 每一周期可使目的基因擴(kuò)增一倍 ， 經(jīng) 30個(gè)周期可擴(kuò)增 230目的基因片段 。 （ 4） ． 對(duì)芯片上的熒光作掃描和分析 。 (2)． 將患者的體細(xì)胞 （ 稱(chēng)靶細(xì)胞 ） 作體外培養(yǎng) ， 常用的有 T淋巴細(xì)胞 ， 骨髓干細(xì)胞 ， 皮膚成纖維細(xì)胞 、 肌細(xì)胞 、 肝細(xì)胞等 (3)． 外源基因的轉(zhuǎn)移 ， 將外源基因通過(guò)載體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中 ， 常用轉(zhuǎn)染的方法 （ 加入磷酸鈣 ） 導(dǎo)入到細(xì)胞中 ， 并與細(xì)胞中核 DNA整合到一起 ， 也可用重組病毒感染靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移外源基因 。 （ 5） ． 將含有正?；虻?T淋巴細(xì)胞回輸?shù)交颊叩墓撬杞M織中。 Gene therapy for treatment of severe bined immunodeficiency (SCID), a fatal disorder of the immune system caused by absence of the enzyme adenosine deaminase (ADA) Ashanti DiSilva, the first person to be treated by gene therapy. 第八節(jié) 基因工程生物技術(shù)和社會(huì)倫理問(wèn)題 由于生物技術(shù)與人類(lèi)社會(huì)的密切聯(lián)系，所以引起的爭(zhēng)論也十分強(qiáng)烈。 重癥聯(lián)合免疫缺陷 （ Severe bined immunodeficiency disease， 簡(jiǎn)稱(chēng) SCID） ， 患者缺乏正常人體免疫功能 ， 其染色體上編碼 腺苷脫氨酶 （ 簡(jiǎn)稱(chēng) ADA） 的基因發(fā)生突變所致 。 遺 傳 疾 病 的 分 類(lèi) （一）染色體病 （二）單基因遺傳病 （三）多基因遺傳病 遺傳病的發(fā)病率有增高趨勢(shì) ? 1956年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 4‰ ； ? 1968年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 6‰ ； ? 1977年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 ‰ ； 遺傳病本身具有的嚴(yán)重性 ? 遺傳性 (hereditary): 患者家庭的上、下垂直發(fā)病或同代間的水平發(fā)病， 家系中往往有多個(gè)發(fā)病的個(gè)體； ? 先天性 (inborn): 在胎兒期即存在遺傳損害，生后即出現(xiàn)缺陷，給預(yù)防和治療造成極大的困難； ? 終生性 (life long): 患者受累終生直至死亡 （ AR） （ AR） （ AR） （ AD） （ XR） （線粒體?。? 遺傳服務(wù)中應(yīng)遵循的倫理學(xué)原則 遺傳服務(wù)的四大倫理原則 ? 尊 重 自 主 ? 行 善 ? 無(wú) 傷 害 ? 公 正 產(chǎn)前診斷中涉及道德問(wèn)題上的 4項(xiàng)基本準(zhǔn)則 ? 尊重夫婦雙方的選擇 ? 對(duì)個(gè)人和家庭不產(chǎn)生傷害 ? 產(chǎn)前診斷的結(jié)果可靠 ? 產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢(xún)的自愿性 二、基因治療（ gene therapy） 人類(lèi)的遺傳性疾病治療的常規(guī)方法： （ 1） 手術(shù)治療 ， 如先天性心臟病通過(guò)手術(shù)加以矯正 .（ 2）藥物治療 ， 如生長(zhǎng)激素缺乏癥 （ 侏儒 ） 可注射人生長(zhǎng)激素等 。 4. 基因芯片技術(shù) （ DNA microarrays or DNA chips) □ 概念： 基因芯片技術(shù)是 DNA雜交探針與半導(dǎo)體工業(yè)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。 Genotype determination using allelespecific oligonucleotides (ASOs). 197 3. PCR檢測(cè)法 用 Southern雜交法對(duì)鐮形細(xì)胞貧血癥作產(chǎn)前診斷需要足夠的細(xì)胞， 并需提取純化 DNA， 并作酶切和雜交等步驟 ， 不但所需時(shí)間較長(zhǎng) ， 而且有一定的風(fēng)險(xiǎn) 。 正常紅細(xì)胞 鐮形紅細(xì)胞 （ 2） 檢測(cè)原理： 由于血紅蛋白基因上單個(gè)核苷酸的替換 （ A→T） ，使該部位的正常序列由 CCTGAGG變成 CCTGTGG， 從而使患者 DNA中消失了一個(gè)可被特定內(nèi)切酶 （ Mst II） 切割的切點(diǎn) 。 是全世界注目的焦點(diǎn) ， 有人設(shè)計(jì)了克隆人的技術(shù)路線 動(dòng)物克隆中急待解決的問(wèn)題 低 (13%) 化是影響克隆胚胎發(fā)育的重要因素 . : 發(fā)現(xiàn)有些克隆動(dòng)物的線粒體 (mtDNA)為雜合體 ,既有受體胞質(zhì)的 ,也有供體細(xì)胞來(lái)的 . ： 正常細(xì)胞沒(méi)有端粒酶，所以端粒會(huì)隨著細(xì)胞分裂而變短，細(xì)胞衰老。 4. 以后長(zhǎng)期用較晚期胚胎細(xì)胞和體細(xì)胞核移植一直失敗 ， 產(chǎn)生了一種觀點(diǎn)：用高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞進(jìn)行克隆在生物學(xué)上是不可能的 ? 5. Wilmut， 1997年 ， 用綿羊乳腺細(xì)胞核移植 ，實(shí)現(xiàn)了在去核卵細(xì)胞中重新編程（ Reprogramming） ， 開(kāi)創(chuàng)了高等動(dòng)物體細(xì)胞克隆新時(shí)期 。 例如植物體的每個(gè)細(xì)胞都具有在離體條件下誘導(dǎo)分化形成完整植株的能力 ， 這是由于每個(gè)細(xì)胞都具有完整基因組實(shí)現(xiàn)的 。 治療遺傳病 去除多余基因或修飾改造原有異?；蛞赃_(dá)到治療的目的 . 五 . 動(dòng)物克隆技術(shù) 克隆的基本概念 克隆是英文 clone的譯音，最早來(lái)自希臘字 clonos，意指樹(shù)枝條。 由于人和老鼠的基因非常接近，因此當(dāng)懷疑人類(lèi)基因圖譜中的某一片段同某種疾病相關(guān)時(shí)，就將老鼠體內(nèi)的這個(gè)基因去除掉，看它會(huì)長(zhǎng)成什么樣。 (2).改變動(dòng)物基因型使其表型更符合人類(lèi)需要 。 葉片用抗乙肝病毒表面抗原的抗體處理的結(jié)果。 1. 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 自然界某些植物受到農(nóng)桿菌的侵染會(huì)形成腫瘤 ——冠癭瘤。通過(guò)重組病毒空斑純化得到能表達(dá)外源基因的重組病毒。 3. 在感染后 12h采用出芽方式離開(kāi)宿主細(xì)胞，在跨過(guò)宿主細(xì)胞的質(zhì)膜時(shí)，以宿主的質(zhì)膜形成自己的外被，形成表型為 出芽型病毒粒子（ budded virus, BV） ， 生活史 Polyhedrin Protein Virion Envolope Nucleocapsid crosssection Nucleocapsid Longitudinalsection Polyhedron envelope DNA蛋白復(fù)合體由 39KD衣殼蛋白外被所包圍，形成一個(gè)核衣殼，若干個(gè)核衣殼外面再包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。 induced by IPTG。 表達(dá)載體 pET15bF 構(gòu)建示意圖 F抗原表達(dá) 經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后，含表達(dá)載體 pET15bF的表達(dá)菌株表達(dá)出一外源蛋白，該蛋白大小在 43kD左右，與文獻(xiàn)報(bào)道大鼠 F蛋白大小一致。 □ 胰島素是治療糖尿病的重要藥物 ， 之前從豬或牛的胰腺中提取分離 ， 含量少而且會(huì)有毒素 。 Sanger DNA 序列分析示意圖 DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all binations of chains are produced. 1620 Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base. 思考題： 假定某一克隆基因的部分序列為5 ， —TCACGTAAGT—3 ， ， 試根據(jù)Sanger序列分析方法原理 畫(huà)出測(cè)定上述序列的放射自顯影示意圖 ， 并對(duì)示意圖作必要的標(biāo)注和解釋 。 為此 Sanger第二次獲得諾貝爾獎(jiǎng) 。 思考題： 假定人生長(zhǎng)激素基因的 cDNA(1kb)已經(jīng)插入在某一載體的 BamHI和 EcoRI的酶切位點(diǎn)中，該克隆大小為 5kb。 2． Southern Blotting 酶切和電泳只能對(duì)重組克隆作出初步鑒定，可得知克隆片段的大小但尚難確定克隆片段是否目的基因。 4． 表達(dá)載體 Expression Vect