【正文】 ral advantages as a vactor for cloning Cloning with a plasmid vector. 169 利用 Lac Z基因的插入失活篩選重組子 許多載體的多克隆位點區(qū)插入在Lac Z基因區(qū)中。 分離這種復制型的雙鏈可用作克隆的載體 。 組成一個基因文庫的全部重組質?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個生物整個基因組。 * 一個基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別 ， 為什么 ？ 4． 直接分析克隆基因表達的蛋白 在生物的不同器官和組織，或在細胞的不同的分化階段會有某些特定基因的表達，此時細胞中的特定基因會特異性轉錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉錄方法獲得該基因的cDNA。 思考：如何用分子雜交法 篩選和 鑒定一個野生型和一個突變型基因？ 第五節(jié) DNA序列分析 DNA序列分析是最終了解基因結構和組成的重要工具 ,在人類基因組計劃中測定人基因組的全部核苷酸序列是該計劃的核心 。 如在加有 ddATP的反應管中產(chǎn)生的是一系列以 A為結尾的寡核苷酸鏈；在加有 ddGTP的反應管中形成的是以 G為結尾一組寡核苷酸鏈等等 ， 再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 轉膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出 DNA序列 。 目前有幾十種基因工程藥物 ， 常用的有：干擾素 、 白細胞介素 、 乙肝疫苗 、 人胰島素和人生長激素等 。 提取大鼠肝臟總 RNA，對其進行反轉錄和 PCR（ RTPCR）擴增出目的基因（ Fantigen’s cDNA），然后將其與 pET15b載體進行連接，轉化大腸桿菌 BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上篩選轉化子。 of the lysate。 苜蓿尺蠖核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV)作為桿狀病毒 昆蟲細胞真核基因表達系統(tǒng)的載體被廣泛應用。 由于這兩個特點 ， 使人們得以設計利用桿狀病毒啟動子在昆蟲細胞中表達外源基因 . 桿狀病毒表達載體構建 由于 AcMNPV基因組的巨大 ， 不可能用單一的限制性酶來對它進行操作 ， 所以目前使用的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)大多采用構建轉移載體 （ transfer vector）的方法 。 與野生型病毒共轉染培養(yǎng)的昆蟲細胞 用磷酸鈣沉淀法將重組轉移載體質粒pVL1393hGH與野生型病毒 AcMNPV DNA共轉染貼壁培養(yǎng)狀態(tài)良好的 Sf9細胞，由于pVL1393多角體啟動子兩側存在與多角體基因同源序列，可與野生型病毒基因發(fā)生同源重組，從而使人生長激素基因替代野生型病毒中的多角體蛋白基因，得到重組病毒 rAcVhGH 。 草甘膦能被植物細胞的葉綠體的酶（EPSP合成酶 ）所分解，該酶對細菌和植物中的氨基酸的合成很重要，沒有這種酶的作用，植物就會干枯和死亡。 5． 轉基因植株的遺傳 以孟德爾比例傳遞 。所以， 通過培育缺陷性狀得到矯正的動物 (或細胞 ) 可以為這類疾病的基因治療提供動物 (或細胞 )模型。 基因敲除的應用領域主要有： 建立人類疾病的轉基因動物模型 基因敲除小鼠是研究疾病的發(fā)生機理、分子基礎及診斷治療的重要實驗材料。 根據(jù)細胞理論 ， 提出高等植物器官和組織可以不斷分割直至單個細胞的觀點 。 1962年 Gurdon 用成年蛙體細胞克隆出青蛙， 1965年童第周完成了金魚的核移植成功。 轉基因體細胞克隆技術比轉基因動物（通過原核注射）的方法優(yōu)越：后者整合率和表達率低，經(jīng)常出現(xiàn)嵌合體。 □ 人類遺傳性 疾病的產(chǎn)前診斷 人類有 200多種遺傳病可用基因診斷技術作出準確的診斷，甚至在發(fā)病前和出生前作出診斷。 因為野生型和突變型只差一個核苷酸 ， 都可能與正常野生型探針雜交 。 每一周期可使目的基因擴增一倍 ， 經(jīng) 30個周期可擴增 230目的基因片段 。 （ 4） ． 對芯片上的熒光作掃描和分析 。 (2)． 將患者的體細胞 （ 稱靶細胞 ） 作體外培養(yǎng) ， 常用的有 T淋巴細胞 ， 骨髓干細胞 ， 皮膚成纖維細胞 、 肌細胞 、 肝細胞等 (3)． 外源基因的轉移 ， 將外源基因通過載體導入到靶細胞中 ， 常用轉染的方法 （ 加入磷酸鈣 ） 導入到細胞中 ， 并與細胞中核 DNA整合到一起 ， 也可用重組病毒感染靶細胞轉移外源基因 。 （ 5） ． 將含有正?；虻?T淋巴細胞回輸?shù)交颊叩墓撬杞M織中。 Gene therapy for treatment of severe bined immunodeficiency (SCID), a fatal disorder of the immune system caused by absence of the enzyme adenosine deaminase (ADA) Ashanti DiSilva, the first person to be treated by gene therapy. 第八節(jié) 基因工程生物技術和社會倫理問題 由于生物技術與人類社會的密切聯(lián)系，所以引起的爭論也十分強烈。 重癥聯(lián)合免疫缺陷 （ Severe bined immunodeficiency disease， 簡稱 SCID） ， 患者缺乏正常人體免疫功能 ， 其染色體上編碼 腺苷脫氨酶 （ 簡稱 ADA） 的基因發(fā)生突變所致 。 遺 傳 疾 病 的 分 類 （一）染色體病 （二）單基因遺傳病 （三）多基因遺傳病 遺傳病的發(fā)病率有增高趨勢 ? 1956年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 4‰ ； ? 1968年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 6‰ ； ? 1977年活嬰中有先天性缺陷患兒的比例約 ‰ ； 遺傳病本身具有的嚴重性 ? 遺傳性 (hereditary): 患者家庭的上、下垂直發(fā)病或同代間的水平發(fā)病， 家系中往往有多個發(fā)病的個體； ? 先天性 (inborn): 在胎兒期即存在遺傳損害，生后即出現(xiàn)缺陷，給預防和治療造成極大的困難； ? 終生性 (life long): 患者受累終生直至死亡 （ AR） （ AR） （ AR） （ AD） （ XR） （線粒體?。? 遺傳服務中應遵循的倫理學原則 遺傳服務的四大倫理原則 ? 尊 重 自 主 ? 行 善 ? 無 傷 害 ? 公 正 產(chǎn)前診斷中涉及道德問題上的 4項基本準則 ? 尊重夫婦雙方的選擇 ? 對個人和家庭不產(chǎn)生傷害 ? 產(chǎn)前診斷的結果可靠 ? 產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢的自愿性 二、基因治療（ gene therapy） 人類的遺傳性疾病治療的常規(guī)方法： （ 1） 手術治療 ， 如先天性心臟病通過手術加以矯正 .（ 2）藥物治療 ， 如生長激素缺乏癥 （ 侏儒 ） 可注射人生長激素等 。 4. 基因芯片技術 （ DNA microarrays or DNA chips) □ 概念： 基因芯片技術是 DNA雜交探針與半導體工業(yè)技術相結合的產(chǎn)物。 Genotype determination using allelespecific oligonucleotides (ASOs). 197 3. PCR檢測法 用 Southern雜交法對鐮形細胞貧血癥作產(chǎn)前診斷需要足夠的細胞， 并需提取純化 DNA， 并作酶切和雜交等步驟 ， 不但所需時間較長 ， 而且有一定的風險 。 正常紅細胞 鐮形紅細胞 （ 2） 檢測原理： 由于血紅蛋白基因上單個核苷酸的替換 （ A→T） ，使該部位的正常序列由 CCTGAGG變成 CCTGTGG， 從而使患者 DNA中消失了一個可被特定內切酶 （ Mst II） 切割的切點 。 是全世界注目的焦點 ， 有人設計了克隆人的技術路線 動物克隆中急待解決的問題 低 (13%) 化是影響克隆胚胎發(fā)育的重要因素 . : 發(fā)現(xiàn)有些克隆動物的線粒體 (mtDNA)為雜合體 ,既有受體胞質的 ,也有供體細胞來的 . ： 正常細胞沒有端粒酶，所以端粒會隨著細胞分裂而變短，細胞衰老。 4. 以后長期用較晚期胚胎細胞和體細胞核移植一直失敗 ， 產(chǎn)生了一種觀點：用高度分化的動物體細胞進行克隆在生物學上是不可能的 ? 5. Wilmut， 1997年 ， 用綿羊乳腺細胞核移植 ，實現(xiàn)了在去核卵細胞中重新編程（ Reprogramming） ， 開創(chuàng)了高等動物體細胞克隆新時期 。 例如植物體的每個細胞都具有在離體條件下誘導分化形成完整植株的能力 ， 這是由于每個細胞都具有完整基因組實現(xiàn)的 。 治療遺傳病 去除多余基因或修飾改造原有異常基因以達到治療的目的 . 五 . 動物克隆技術 克隆的基本概念 克隆是英文 clone的譯音，最早來自希臘字 clonos，意指樹枝條。 由于人和老鼠的基因非常接近，因此當懷疑人類基因圖譜中的某一片段同某種疾病相關時，就將老鼠體內的這個基因去除掉，看它會長成什么樣。 (2).改變動物基因型使其表型更符合人類需要 。 葉片用抗乙肝病毒表面抗原的抗體處理的結果。 1. 冠癭瘤 ——天然的植物基因工程 自然界某些植物受到農(nóng)桿菌的侵染會形成腫瘤 ——冠癭瘤。通過重組病毒空斑純化得到能表達外源基因的重組病毒。 3. 在感染后 12h采用出芽方式離開宿主細胞，在跨過宿主細胞的質膜時，以宿主的質膜形成自己的外被，形成表型為 出芽型病毒粒子（ budded virus, BV） ， 生活史 Polyhedrin Protein Virion Envolope Nucleocapsid crosssection Nucleocapsid Longitudinalsection Polyhedron envelope DNA蛋白復合體由 39KD衣殼蛋白外被所包圍，形成一個核衣殼，若干個核衣殼外面再包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。 induced by IPTG。 表達載體 pET15bF 構建示意圖 F抗原表達 經(jīng) IPTG誘導后，含表達載體 pET15bF的表達菌株表達出一外源蛋白，該蛋白大小在 43kD左右，與文獻報道大鼠 F蛋白大小一致。 □ 胰島素是治療糖尿病的重要藥物 ， 之前從豬或牛的胰腺中提取分離 ， 含量少而且會有毒素 。 Sanger DNA 序列分析示意圖 DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all binations of chains are produced. 1620 Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base. 思考題： 假定某一克隆基因的部分序列為5 ， —TCACGTAAGT—3 ， ， 試根據(jù)Sanger序列分析方法原理 畫出測定上述序列的放射自顯影示意圖 ， 并對示意圖作必要的標注和解釋 。 為此 Sanger第二次獲得諾貝爾獎 。 思考題： 假定人生長激素基因的 cDNA(1kb)已經(jīng)插入在某一載體的 BamHI和 EcoRI的酶切位點中，該克隆大小為 5kb。 2． Southern Blotting 酶切和電泳只能對重組克隆作出初步鑒定，可得知克隆片段的大小但尚難確定克隆片段是否目的基因。 4． 表達載體 Expression Vect