【正文】 正常 葉片 4. 具有易于長期保鮮的轉基因西紅柿的制作過程原理如下： 通常的西紅柿不易保存保鮮，這是由于一種蛋白酶的催化成熟的結果。 (3).可用轉基因動物產(chǎn)生人類需要的生物活性物質 . 轉基因生物反應器 □ 定義： 將目的基因導入動物體內(nèi)形成轉基因生物，由于基因表達，可以從轉基因動物的特定組織或器官（乳汁、血液等）獲得目的基因產(chǎn)物。 如果沒眼，那么被去除的基因就是決定長眼的基因。動詞 clonizos是砍樹枝。 植物細胞全能性實驗的重要事件： 1. Steward， 1958， 從胡羅卜根游離單細胞培養(yǎng)成完整植株 。 動物克隆技術的發(fā)展經(jīng)歷從胚胎細胞的克隆（包括胚胎切割）到體細胞克隆的過程 胚胎細胞克隆技術 產(chǎn)生的新個體并非是親代的自我復制， 而是多生了幾 個雙胞胎，并未引起世人注意。那么 克隆動物是否會隨著供體細胞的縮短的端粒而提前衰老呢？ 有發(fā)現(xiàn) Dolly 羊的端粒限制性片段平均長度（ mean terminal restriction fragment,TRF) 比同齡對照短。 Mst II識別的序列為 CC↑TNAGG。 PCR法：根據(jù) β珠蛋白基因序列設計二條引物；取得極微量胎兒絨毛細胞或患者血液，裂介細胞粗提 DNA，然后作 PCR擴增，無論是正?；虍惓Ｕ叨紩a(chǎn)生 DNA片段。將各種探針固定于支持物上后與帶有熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號，進而獲取被測樣品中 DNA分子的數(shù)量和序列信息。 □ 基因治療定義 ： 應用基因工程手段用正常基因導入基因有缺陷的靶細胞中 ， 使正?；虮磉_ ， 并合成相應的產(chǎn)物 ， 使細胞恢復正常的功能 ， 使疾病得到治療 。 由于 ADA是嘌呤代謝中的一種酶 ， 該基因缺陷將導致患者身體細胞中脫氧腺苷的累積 ， 達到高濃度時脫氧腺苷將對免疫系統(tǒng)細胞 （ 如 T細胞和 B細胞 ） 產(chǎn)生毒性 。 “巨大的力量意味著重大的責任” ——美國總統(tǒng)生命倫理咨詢委員會 伯格會議和 HGP的啟示 美國斯坦福大學教授 1975 伯格會議 是否可暫停基因重組實驗，先著手制定共同遵循的規(guī)范 伯格會議和 HGP的啟示 人類基因組計劃 （ HGP） 相關倫理、法律和社會影響的研究 （ ELSI） 生命科學史乃至全部科學技術史上的第一次 600萬猶太亡靈的呼喚 信奉優(yōu)生學的科學家把 《 人類遺傳學 和種族衛(wèi)生概念 》 等狂熱鼓吹人類不 平等的優(yōu)生學著作送給希特勒，成為 他推行種族屠殺政策的重要“科學”依據(jù) 日本 731部隊的細菌武器試驗 731部隊遺址 從 1933年至 1945年， 731部 隊等一直在進行人體細菌武 器試驗。 （ 4） ． 培養(yǎng)細胞并確認該基因正常表達 。 1. 基因治療方法和步驟 (1)．通常將正常的基因首先與基因轉移的載體相連接， 常采用的載體有 反轉錄病毒載體和腺病毒載體 。 （ 3） ． 將樣品滴加到芯片上并與芯片上的探針雜交， 凡是與探針互補的酶切片段會固定于特定位置上 ，不能互補的片段會被洗脫掉 。 （ 3） 鏈延伸：在 72℃ ， 以單鏈為模板 ， 在引物的 3’末端以互補原則合成新鏈 。 ( 4 ). Southern雜交檢測結果 2 、 異 常 序 列 檢 測 ( allelespecific oligonucleotides, ASO) 如果某一特定核苷酸發(fā)生異常 ， 可用在該基因相應區(qū)段上正常的野生型序列的寡核苷酸作為探針 ， 經(jīng)Southern雜交確定： 雜交時的溫度是重要條件 。如 HIV的 DNA序列已經(jīng)搞清，可以根據(jù)該序列設計合成一段引物，再從受檢人的血液或組織中抽提極微量的 DNA為模板進行 DNA的擴增，如獲得與 HIV DNA序列相同的特定長度的DNA片段，即可確定受檢者攜帶 HIV病毒。 克隆羊 “ 多莉 ” 的誕生說明動物體細胞也具有全能性 ， 因此它是真正意義上的動物克隆 ， 動物克隆的基本過程 以克隆羊為例，動物克隆的基本過程如下圖 克隆動物的應用： 1. 快速克隆出優(yōu)良的種畜和遺傳上一致的實驗動物； 2. 動物資源的種質保存，包括地球上頻危動物的挽救等（異種核 移植） ； 3. 生產(chǎn)移植器官； 4. 與轉基因技術相結合研制生物反應器生產(chǎn)基因藥物。 關鍵的問題是：動物細胞的分化過程是不可逆的嗎？ 1. 動物克隆的早期設想： 1938年，德國胚胎學家 Hans Spemann提出了用成年體細胞的核移植到未受精的卵細胞中，來實現(xiàn)動物的無性繁殖，未成功 2. 從低等動物開始，兩棲類和魚類 1952年 Robert Briggs和 Thomas J King用囊胚核移植方法產(chǎn)生了蝌蚪，未生成青蛙。 克隆技術所依賴的理論基礎 19世紀 30年代提出細胞學說 ， 細胞是生物有機體的結構和生命活動的單位 ， 又是生物個體和系統(tǒng)發(fā)育的基礎 ， 1902年 Haberlandt提出植物細胞全能性的設想 。既可以是用突變基因敲除相應的正?；?，也可以用正常基因敲除相應的突變基因。但這種操作具有一定的危險性，必須首先在動物體內(nèi)進行試驗。 轉基因西紅柿的途徑 5． 植物細胞的轉化方法 （ 1） 葉圓片共培養(yǎng)轉化 （ 2） 單細胞水平上的轉化 在 Kan培養(yǎng)基上選擇轉化的組織 ——再生植株 。 Cointegrate Tiplasmid Tobacco plant cell Trasformed cell Cultured cell Plantlet Transgenic tobacco plant Cell of transgenic plant 植物基因工程 程序圖 3. 抗除草劑基因工程 (Gene transfer of glyphosate resistance) 草甘膦在低濃度時非常有效，對人無毒，可被土壤中微生物分解。 用重組病毒感染宿主細胞 ， 感染后期得到外源基因的高效表達 。 Fig Schematic representation of the four phases of baculovirus gene expression in vitro 多角體蛋白 P10蛋白 由于 多角體蛋白基因及 P10蛋白基因具有非常高效的啟動子 ， 同時由于 這兩個基因的產(chǎn)物不參與感染病毒顆粒的形成 ， 可以從病毒基因組中去除而不會對病毒的復制及感染造成影響 。 幾種重要的基因工程藥物已可用真核細胞反應器完成 治療癌癥抗病毒 預防病毒性肝炎 治療血友病 治療貧血癥 治療心臟病 促生長，增強免疫功能 酵母菌 酵母菌 哺乳動物細胞 哺乳動物細胞 哺乳動物細胞 昆蟲細胞 α干擾素 乙肝疫苗 集落刺激因子 紅細胞生成素 組織溶纖酶原激活劑 人生長激素 應 用 細 胞 名 稱 昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng) (Insect cell and Baculovirus Expression System) 是一種高效的真核細胞表達系統(tǒng) 桿狀病毒因其病毒粒子呈棒狀或桿狀而得名。 body of the lysate。 方法： 基因克隆。 （ 2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高醫(yī)療價值的藥物，用常規(guī)分離的方法很難制取。 如下圖： aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑ ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA 175 189 445 aa1 aa2 3 4 89 90 ↓ 基因 E開始 基因 E終止 ↑ 基因 D開始 基因 D終止 Sanger序列分析方法原理 采用單鏈 DNA（ 或將含有外源基因的重組質粒 DNA變性 ） ， 在引物和 DNA聚合酶的作用下 ， 在四組獨立的反應中除加有 4種 dNTPs外 （ 其中之一為同位素標記 ） ， 再分別加入 4種 ddNTPs中的一種作為鏈延伸的終止劑 ， 結果將在四組反應管中產(chǎn)生長度不等的 4組寡核苷酸鏈 ， 它們分別終止于被測鏈的每一個 A、 G、 C或 T。在聚合酶作用下，合成一條互補的含有突變基因的鏈，將雜合雙鏈引入大腸桿菌細胞，經(jīng)復制后會產(chǎn)生一個野生型和一個突變型基因的細胞，再用分子雜交法作鑒定。 用反轉譯酶從 mRNA制備 cDNA， 全部 cDNA片段與質粒載體相連 ， 轉化 cDNA文庫 。 2 ．用一目的基因的一個探針從整個 DNA酶切片段的集合體中選出合適的酶切片段，然后再克隆特定的片段。 3． 單鏈病毒 在感染 ， 感染性單鏈能轉變?yōu)殡p鏈的復制型 。 (4) 比較容易從宿主細胞中回收 1． 質粒 ： 雙鏈環(huán)狀 DNA分子 ， 能經(jīng)轉化導入 優(yōu)點：能使宿主細胞產(chǎn)生抗性 ， 便于選擇質粒， 在細胞中的拷貝數(shù)多 。組成一個生物的基因文庫的全部重組質粒或重組噬菌體中的目的基因就代表了一個生物的整個基因組。 大量培養(yǎng)細胞可獲得目的基因的大量拷貝，或基因表達的產(chǎn)物等。如用 Hind Ⅲ 消化獲得 和 。 由于切點是錯開的 ， 因此使 SV40的環(huán)狀分子切開成具有 粘性末端 （ sticky ends） 的線狀分子 。 In situ hybridization of human metaphase chromosomes using fluorescent technique (FISH) 第二節(jié) 限制性內(nèi)切酶 一 、 宿主限制現(xiàn)象 X X A B XA XB A B A B XA XB XA XB 100% 100% % 100% Phage Infect Bacteria 從兩個不同菌株 A和 B來的噬菌體 X具有不同的感染能力 XA A XA B XB A XA 100% 100% 很差 無法分離到能感染 A細菌的 XB來的噬菌體 用很少一些感染力差的 結果說明： 噬菌體的宿主范圍取決于它所來源的細菌菌株 ， 而不是噬菌體的基因型； 宿主的基因型對噬菌體有一種修飾作用 ， 但并不改變噬菌體 DNA的序列 。第四章 基因操作 Gene manipulation 第一節(jié) 堿基互補的能力 一 、 DNA的熱變性 1． G－ C含量高的 DNA具有較高的熔解溫度 ， 可以根據(jù)熔解溫度的不同將 GC含量不同的 DNA分子分開 ， 并可推測 DNA分子中 G－ C的相對含量 。細菌的基因型決定該細菌對各種噬菌體感染的敏感性， 一種噬菌體的基因型決定它所能感染細菌的范圍 ，它們之間具有密切的依賴和限止關系 。 上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保護 DNA免受 EcoRI的切割 。如用上述兩酶混合消化獲得 、 。 一般意義上的重組DNA技術專指在細菌細胞中特異性地擴增特定 DNA片段的分子克隆技術，廣義上的重組 DNA技術還延伸到整個基因工程的應用領域 。 一 、 直接產(chǎn)生粘性末端用于組成一個新的重組DNA分子 （ rebinant DNA） 162 二 、 加尾連接 （ Tailing） 1． 同聚物加尾 末端轉移酶 （ terminal transferase） 能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾 ， 如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端 ， 就可以連接成重組質粒 ， polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。 A colorenhanced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium . .The plasmid pUC18 offers seve