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第四章基因操作ppt課件-文庫吧在線文庫

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【正文】 正常 葉片 4. 具有易于長(zhǎng)期保鮮的轉(zhuǎn)基因西紅柿的制作過程原理如下: 通常的西紅柿不易保存保鮮,這是由于一種蛋白酶的催化成熟的結(jié)果。 (3).可用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生人類需要的生物活性物質(zhì) . 轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器 □ 定義: 將目的基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)形成轉(zhuǎn)基因生物,由于基因表達(dá),可以從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特定組織或器官(乳汁、血液等)獲得目的基因產(chǎn)物。 如果沒眼,那么被去除的基因就是決定長(zhǎng)眼的基因。動(dòng)詞 clonizos是砍樹枝。 植物細(xì)胞全能性實(shí)驗(yàn)的重要事件: 1. Steward, 1958, 從胡羅卜根游離單細(xì)胞培養(yǎng)成完整植株 。 動(dòng)物克隆技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷從胚胎細(xì)胞的克?。òㄅ咛デ懈睿┑襟w細(xì)胞克隆的過程 胚胎細(xì)胞克隆技術(shù) 產(chǎn)生的新個(gè)體并非是親代的自我復(fù)制, 而是多生了幾 個(gè)雙胞胎,并未引起世人注意。那么 克隆動(dòng)物是否會(huì)隨著供體細(xì)胞的縮短的端粒而提前衰老呢? 有發(fā)現(xiàn) Dolly 羊的端粒限制性片段平均長(zhǎng)度( mean terminal restriction fragment,TRF) 比同齡對(duì)照短。 Mst II識(shí)別的序列為 CC↑TNAGG。 PCR法:根據(jù) β珠蛋白基因序列設(shè)計(jì)二條引物;取得極微量胎兒絨毛細(xì)胞或患者血液,裂介細(xì)胞粗提 DNA,然后作 PCR擴(kuò)增,無論是正?;虍惓U叨紩?huì)產(chǎn)生 DNA片段。將各種探針固定于支持物上后與帶有熒光標(biāo)記的DNA樣品分子進(jìn)行雜交,通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào),進(jìn)而獲取被測(cè)樣品中 DNA分子的數(shù)量和序列信息。 □ 基因治療定義 : 應(yīng)用基因工程手段用正?;?qū)牖蛴腥毕莸陌屑?xì)胞中 , 使正?;虮磉_(dá) , 并合成相應(yīng)的產(chǎn)物 , 使細(xì)胞恢復(fù)正常的功能 , 使疾病得到治療 。 由于 ADA是嘌呤代謝中的一種酶 , 該基因缺陷將導(dǎo)致患者身體細(xì)胞中脫氧腺苷的累積 , 達(dá)到高濃度時(shí)脫氧腺苷將對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞 ( 如 T細(xì)胞和 B細(xì)胞 ) 產(chǎn)生毒性 。 “巨大的力量意味著重大的責(zé)任” ——美國(guó)總統(tǒng)生命倫理咨詢委員會(huì) 伯格會(huì)議和 HGP的啟示 美國(guó)斯坦福大學(xué)教授 1975 伯格會(huì)議 是否可暫?;蛑亟M實(shí)驗(yàn),先著手制定共同遵循的規(guī)范 伯格會(huì)議和 HGP的啟示 人類基因組計(jì)劃 ( HGP) 相關(guān)倫理、法律和社會(huì)影響的研究 ( ELSI) 生命科學(xué)史乃至全部科學(xué)技術(shù)史上的第一次 600萬猶太亡靈的呼喚 信奉優(yōu)生學(xué)的科學(xué)家把 《 人類遺傳學(xué) 和種族衛(wèi)生概念 》 等狂熱鼓吹人類不 平等的優(yōu)生學(xué)著作送給希特勒,成為 他推行種族屠殺政策的重要“科學(xué)”依據(jù) 日本 731部隊(duì)的細(xì)菌武器試驗(yàn) 731部隊(duì)遺址 從 1933年至 1945年, 731部 隊(duì)等一直在進(jìn)行人體細(xì)菌武 器試驗(yàn)。 ( 4) . 培養(yǎng)細(xì)胞并確認(rèn)該基因正常表達(dá) 。 1. 基因治療方法和步驟 (1).通常將正常的基因首先與基因轉(zhuǎn)移的載體相連接, 常采用的載體有 反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體 。 ( 3) . 將樣品滴加到芯片上并與芯片上的探針雜交, 凡是與探針互補(bǔ)的酶切片段會(huì)固定于特定位置上 ,不能互補(bǔ)的片段會(huì)被洗脫掉 。 ( 3) 鏈延伸:在 72℃ , 以單鏈為模板 , 在引物的 3’末端以互補(bǔ)原則合成新鏈 。 ( 4 ). Southern雜交檢測(cè)結(jié)果 2 、 異 常 序 列 檢 測(cè) ( allelespecific oligonucleotides, ASO) 如果某一特定核苷酸發(fā)生異常 , 可用在該基因相應(yīng)區(qū)段上正常的野生型序列的寡核苷酸作為探針 , 經(jīng)Southern雜交確定: 雜交時(shí)的溫度是重要條件 。如 HIV的 DNA序列已經(jīng)搞清,可以根據(jù)該序列設(shè)計(jì)合成一段引物,再從受檢人的血液或組織中抽提極微量的 DNA為模板進(jìn)行 DNA的擴(kuò)增,如獲得與 HIV DNA序列相同的特定長(zhǎng)度的DNA片段,即可確定受檢者攜帶 HIV病毒。 克隆羊 “ 多莉 ” 的誕生說明動(dòng)物體細(xì)胞也具有全能性 , 因此它是真正意義上的動(dòng)物克隆 , 動(dòng)物克隆的基本過程 以克隆羊?yàn)槔?,?dòng)物克隆的基本過程如下圖 克隆動(dòng)物的應(yīng)用: 1. 快速克隆出優(yōu)良的種畜和遺傳上一致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物; 2. 動(dòng)物資源的種質(zhì)保存,包括地球上頻危動(dòng)物的挽救等(異種核 移植) ; 3. 生產(chǎn)移植器官; 4. 與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合研制生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因藥物。 關(guān)鍵的問題是:動(dòng)物細(xì)胞的分化過程是不可逆的嗎? 1. 動(dòng)物克隆的早期設(shè)想: 1938年,德國(guó)胚胎學(xué)家 Hans Spemann提出了用成年體細(xì)胞的核移植到未受精的卵細(xì)胞中,來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的無性繁殖,未成功 2. 從低等動(dòng)物開始,兩棲類和魚類 1952年 Robert Briggs和 Thomas J King用囊胚核移植方法產(chǎn)生了蝌蚪,未生成青蛙。 克隆技術(shù)所依賴的理論基礎(chǔ) 19世紀(jì) 30年代提出細(xì)胞學(xué)說 , 細(xì)胞是生物有機(jī)體的結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的單位 , 又是生物個(gè)體和系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ) , 1902年 Haberlandt提出植物細(xì)胞全能性的設(shè)想 。既可以是用突變基因敲除相應(yīng)的正?;?,也可以用正?;蚯贸鄳?yīng)的突變基因。但這種操作具有一定的危險(xiǎn)性,必須首先在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。 轉(zhuǎn)基因西紅柿的途徑 5. 植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法 ( 1) 葉圓片共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 ( 2) 單細(xì)胞水平上的轉(zhuǎn)化 在 Kan培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的組織 ——再生植株 。 Cointegrate Tiplasmid Tobacco plant cell Trasformed cell Cultured cell Plantlet Transgenic tobacco plant Cell of transgenic plant 植物基因工程 程序圖 3. 抗除草劑基因工程 (Gene transfer of glyphosate resistance) 草甘膦在低濃度時(shí)非常有效,對(duì)人無毒,可被土壤中微生物分解。 用重組病毒感染宿主細(xì)胞 , 感染后期得到外源基因的高效表達(dá) 。 Fig Schematic representation of the four phases of baculovirus gene expression in vitro 多角體蛋白 P10蛋白 由于 多角體蛋白基因及 P10蛋白基因具有非常高效的啟動(dòng)子 , 同時(shí)由于 這兩個(gè)基因的產(chǎn)物不參與感染病毒顆粒的形成 , 可以從病毒基因組中去除而不會(huì)對(duì)病毒的復(fù)制及感染造成影響 。 幾種重要的基因工程藥物已可用真核細(xì)胞反應(yīng)器完成 治療癌癥抗病毒 預(yù)防病毒性肝炎 治療血友病 治療貧血癥 治療心臟病 促生長(zhǎng),增強(qiáng)免疫功能 酵母菌 酵母菌 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 昆蟲細(xì)胞 α干擾素 乙肝疫苗 集落刺激因子 紅細(xì)胞生成素 組織溶纖酶原激活劑 人生長(zhǎng)激素 應(yīng) 用 細(xì) 胞 名 稱 昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (Insect cell and Baculovirus Expression System) 是一種高效的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 桿狀病毒因其病毒粒子呈棒狀或桿狀而得名。 body of the lysate。 方法: 基因克隆。 ( 2)具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高醫(yī)療價(jià)值的藥物,用常規(guī)分離的方法很難制取。 如下圖: aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑ ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA 175 189 445 aa1 aa2 3 4 89 90 ↓ 基因 E開始 基因 E終止 ↑ 基因 D開始 基因 D終止 Sanger序列分析方法原理 采用單鏈 DNA( 或?qū)⒑型庠椿虻闹亟M質(zhì)粒 DNA變性 ) , 在引物和 DNA聚合酶的作用下 , 在四組獨(dú)立的反應(yīng)中除加有 4種 dNTPs外 ( 其中之一為同位素標(biāo)記 ) , 再分別加入 4種 ddNTPs中的一種作為鏈延伸的終止劑 , 結(jié)果將在四組反應(yīng)管中產(chǎn)生長(zhǎng)度不等的 4組寡核苷酸鏈 , 它們分別終止于被測(cè)鏈的每一個(gè) A、 G、 C或 T。在聚合酶作用下,合成一條互補(bǔ)的含有突變基因的鏈,將雜合雙鏈引入大腸桿菌細(xì)胞,經(jīng)復(fù)制后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)野生型和一個(gè)突變型基因的細(xì)胞,再用分子雜交法作鑒定。 用反轉(zhuǎn)譯酶從 mRNA制備 cDNA, 全部 cDNA片段與質(zhì)粒載體相連 , 轉(zhuǎn)化 cDNA文庫 。 2 .用一目的基因的一個(gè)探針從整個(gè) DNA酶切片段的集合體中選出合適的酶切片段,然后再克隆特定的片段。 3. 單鏈病毒 在感染 , 感染性單鏈能轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型 。 (4) 比較容易從宿主細(xì)胞中回收 1. 質(zhì)粒 : 雙鏈環(huán)狀 DNA分子 , 能經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入 優(yōu)點(diǎn):能使宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗性 , 便于選擇質(zhì)粒, 在細(xì)胞中的拷貝數(shù)多 。組成一個(gè)生物的基因文庫的全部重組質(zhì)?;蛑亟M噬菌體中的目的基因就代表了一個(gè)生物的整個(gè)基因組。 大量培養(yǎng)細(xì)胞可獲得目的基因的大量拷貝,或基因表達(dá)的產(chǎn)物等。如用 Hind Ⅲ 消化獲得 和 。 由于切點(diǎn)是錯(cuò)開的 , 因此使 SV40的環(huán)狀分子切開成具有 粘性末端 ( sticky ends) 的線狀分子 。 In situ hybridization of human metaphase chromosomes using fluorescent technique (FISH) 第二節(jié) 限制性內(nèi)切酶 一 、 宿主限制現(xiàn)象 X X A B XA XB A B A B XA XB XA XB 100% 100% % 100% Phage Infect Bacteria 從兩個(gè)不同菌株 A和 B來的噬菌體 X具有不同的感染能力 XA A XA B XB A XA 100% 100% 很差 無法分離到能感染 A細(xì)菌的 XB來的噬菌體 用很少一些感染力差的 結(jié)果說明: 噬菌體的宿主范圍取決于它所來源的細(xì)菌菌株 , 而不是噬菌體的基因型; 宿主的基因型對(duì)噬菌體有一種修飾作用 , 但并不改變噬菌體 DNA的序列 。第四章 基因操作 Gene manipulation 第一節(jié) 堿基互補(bǔ)的能力 一 、 DNA的熱變性 1. G- C含量高的 DNA具有較高的熔解溫度 , 可以根據(jù)熔解溫度的不同將 GC含量不同的 DNA分子分開 , 并可推測(cè) DNA分子中 G- C的相對(duì)含量 。細(xì)菌的基因型決定該細(xì)菌對(duì)各種噬菌體感染的敏感性, 一種噬菌體的基因型決定它所能感染細(xì)菌的范圍 ,它們之間具有密切的依賴和限止關(guān)系 。 上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保護(hù) DNA免受 EcoRI的切割 。如用上述兩酶混合消化獲得 、 。 一般意義上的重組DNA技術(shù)專指在細(xì)菌細(xì)胞中特異性地?cái)U(kuò)增特定 DNA片段的分子克隆技術(shù),廣義上的重組 DNA技術(shù)還延伸到整個(gè)基因工程的應(yīng)用領(lǐng)域 。 一 、 直接產(chǎn)生粘性末端用于組成一個(gè)新的重組DNA分子 ( rebinant DNA) 162 二 、 加尾連接 ( Tailing) 1. 同聚物加尾 末端轉(zhuǎn)移酶 ( terminal transferase) 能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾 , 如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端 , 就可以連接成重組質(zhì)粒 , polyG和 polyC也可用相同方法加尾 。 A colorenhanced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium . .The plasmid pUC18 offers seve
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