【正文】 同聚物加尾連接的優(yōu)點(diǎn)：加尾后 DNA片段自身不會(huì)環(huán)化 ，可提高異源 DNA重組率 。 缺點(diǎn)：加入的 polyA和 polyT可能影響基因表達(dá)；外源基因克隆擴(kuò)增后不能用限制酶重新從重組質(zhì)粒中切出來(lái) 。 TTAA AATT 5, 3, 3, 5, 5, 3, 3, 5, AAA AAAA 5, 3, 5, 3, AAA AAAA TT TTT TT TT AAAA AAAAA T TT TT TT TT 5, 3, 3, 5, 5, 3, 3, 5, 5, 3, 5, 3, E coRI 外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 dATP shear 外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 dTTP TTTT TTTTT Plasmid DNA Drosophila DNA DNA polymerase,DNA ligase 末端轉(zhuǎn)移酶（terminal transferase）能催化 DNA的 3’末端加上核苷酸尾，如將 dA和 dT加到不同的 DNA末端，就可以連接成重組質(zhì)粒 2． 人工接頭的應(yīng)用 人工接頭是一個(gè)合成的含有特定限制酶識(shí)別順序的核苷酸片段。 EcoRI ↓ C C G A A T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接頭 ↑ EcoRI ＋ T4DAN 連接酶 人工接頭 EcoRI 外源 DNA 粘性末端用于連接載體 人工接頭的應(yīng)用 四 、 載體 Vectors 能使克隆的片段不斷復(fù)制的一類 DNA分子稱載體 ， 應(yīng)具備以下特點(diǎn)： （ 1） 分子量小 ， 核苷酸序列清楚 ， 具有一些單一酶切位點(diǎn)或人工插入的多克隆位點(diǎn)區(qū) 。 （ 2） 分子中具有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn) ， 能使載體自身和插入的外源 DNA共同復(fù)制 。 （ 3） 具有易于篩選重組分子的標(biāo)志 ， 如抗藥性 。 (4) 比較容易從宿主細(xì)胞中回收 1． 質(zhì)粒 ： 雙鏈環(huán)狀 DNA分子 ， 能經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入 優(yōu)點(diǎn)：能使宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗性 ， 便于選擇質(zhì)粒， 在細(xì)胞中的拷貝數(shù)多 。 A colorenhanced electron mincrograph of circular plasmid molecules isolated from the bacterium . .The plasmid pUC18 offers several advantages as a vactor for cloning Cloning with a plasmid vector. 169 利用 Lac Z基因的插入失活篩選重組子 許多載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入在Lac Z基因區(qū)中。 Lac Z基因編碼β半乳糖苷酶的一個(gè)亞基，它可以使攜帶載體的細(xì)菌在含有 Xgal（能被 β半乳糖苷酶水解的底物）的培養(yǎng)界上形成 藍(lán)色的菌落。 當(dāng)外源基因插入到多克隆位點(diǎn)區(qū)后就阻斷了 Lac Z基因的編碼區(qū)，使 Lac Z基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這些細(xì)胞就不能利用 Xgal，結(jié)果在培養(yǎng)基上形成 白色的菌落。 挑選出白色菌落可作進(jìn)一步鑒定。 A Petri plate showing the growth of bacterial cells after uptake of rebinant plasmids. 166 菌落原位雜交篩選和鑒定克隆的基因 根據(jù)重組質(zhì)粒中的目的基因的序列，合成一段與之互補(bǔ)的 DNA序列，并使其標(biāo)記上放射性同位素，該段 DNA稱為探針。再用探針與菌落中的 DNA進(jìn)行雜交，可從許多未知的菌落中挑選出克隆有目的基因的菌落。 2． λ噬菌體 它的頭部通常能包裝進(jìn) 45kb 長(zhǎng)的DNA分子 ， 基因組中間部分是裂解性生長(zhǎng)的非必需區(qū) ， 因此在其區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)換插入大的外源 DNA片段可以不影響其復(fù)制功能 。 3． 單鏈病毒 在感染 ， 感染性單鏈能轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的復(fù)制型 。 分離這種復(fù)制型的雙鏈可用作克隆的載體 。 這種噬菌體用作克隆的優(yōu)點(diǎn)：在重新感染合適的宿主時(shí) ， 它產(chǎn)生的噬菌體顆粒是單鏈 DNA，為 DNA序列分析提供方便 。 4． 表達(dá)載體 Expression Vectors 具有合適的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始信號(hào) ， 外源基因插入合適的區(qū)域后能夠表達(dá)的載體 。 某些載體質(zhì)粒既具有 ， 又具有動(dòng)物病毒 SV40的復(fù)制起點(diǎn) ， 這樣的質(zhì)粒既可在 ， 又可在培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制， 應(yīng)此稱為穿梭載體 。 Shuttle Vectors 第四節(jié) 重組 DNA方法學(xué) 一 、 克隆戰(zhàn)略 1． 無(wú)選擇地從一個(gè)限制酶切的混合物中克隆全部片段 ， 然后再篩選所需的目的基因 。 非選擇性地在細(xì)菌中克隆一個(gè)高等生物的隨機(jī) DNA片段的方法稱為鳥槍法 （ Shotgunning） ，全部克隆的集合體稱為一個(gè)基因文庫(kù) （ gene bank, or gene library） 。 組成一個(gè)基因文庫(kù)的全部重組質(zhì)?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組 。 2 ．用一目的基因的一個(gè)探針從整個(gè) DNA酶切片段的集合體中選出合適的酶切片段，然后再克隆特定的片段。 組成一個(gè)基因文庫(kù)的全部重組質(zhì)?；蛉恐亟M噬菌體代表了一個(gè)生物整個(gè)基因組。 二、鑒定克隆的基因 1．用特定的內(nèi)切酶消化重組質(zhì)粒，電泳比較切出片段的大小。 2． Southern Blotting 酶切和電泳只能對(duì)重組克隆作出初步鑒定，可得知克隆片段的大小但尚難確定克隆片段是否目的基因。 Southern發(fā)明了一種對(duì)電泳凝膠中的 DNA作分子雜交鑒定的方法。該方法可用于重組質(zhì)粒鑒定，轉(zhuǎn)基因生物中外源基因的插入位置，遺傳病的分子診斷等。 單鏈 DNA能結(jié)合到硝酸纖維濾膜上，酶切物經(jīng)電泳后，瓊脂糖膠作變性處理，然后將 DNA吸印到膜上，用 32P標(biāo)記的 DNA或 RNA探針與膜上的 DNA作雜交，自顯影后可顯示出目的基因的位置和大小。 The Southern blotting technique southern blot after hybridization, exposure, and development. The bands show DNA fragments plementary to the nucleotide sequence of the probe. 3． 用 cDNA克隆作探針 ， 從基因文庫(kù)中篩選目的基因克隆 。 用反轉(zhuǎn)譯酶從 mRNA制備 cDNA， 全部 cDNA片段與質(zhì)粒載體相連 ， 轉(zhuǎn)化 cDNA文庫(kù) 。 * 一個(gè)基因的 cDNA克隆和 genomic克隆可能在大小上有很大區(qū)別 ， 為什么 ？ 4． 直接分析克隆基因表達(dá)的蛋白 在生物的不同器官和組織，或在細(xì)胞的不同的分化階段會(huì)有某些特定基因的表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞中的特定基因會(huì)特異性轉(zhuǎn)錄成特定蛋白的mRNA，因此可用反轉(zhuǎn)錄方法獲得該基因的cDNA。 用反轉(zhuǎn)錄酶從 mRNA合成 cDNA；全部 cDNA片段與載體相連并轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞獲得的全部克隆稱 cDNA 文庫(kù) ， 再?gòu)腸DNA文庫(kù)中調(diào)出目的cDNA克隆 。 思考題： 假定人生長(zhǎng)激素基因的 cDNA(1kb)已經(jīng)插入在某一載體的 BamHI和 EcoRI的酶切位點(diǎn)中，該克隆大小為 5kb。例舉兩種鑒定該基因的具體方法，要求寫出實(shí)驗(yàn)步驟，并且用圖表示鑒定結(jié)果。 三，克隆基因的定點(diǎn)誘變 □ 意義 ：基因的功能通常是通過(guò)其突變體來(lái)認(rèn)識(shí)其作用的。在 重組 DNA 技術(shù)中常需研究 DNA 序列上特定部位的功能，或改變 基因編碼區(qū)個(gè)別氨基酸的密碼子以提高該基因表達(dá)蛋白質(zhì)活性 等。 □ 定義 :特異性地改變某一基因的方法稱 定點(diǎn)誘變 sitedirected mutagenesis 克隆基因的定點(diǎn)誘變 根據(jù)基因中欲改變位點(diǎn)的核苷酸序列設(shè)計(jì)一段引物，引物中含有突變的堿基。在聚合酶作用下，合成一條互補(bǔ)的含有突變基因的鏈，將雜合雙鏈引入大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)復(fù)制后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)野生型和一個(gè)突變型基因的細(xì)胞，再用分子雜交法作鑒定。 思考：如何用分子雜交法 篩選和 鑒定一個(gè)野生型和一個(gè)突變型基因？ 第五節(jié) DNA序列分析 DNA序列分析是最終了解基因結(jié)構(gòu)和組成的重要工具 ,在人類基因組計(jì)劃中測(cè)定人基因組的全部核苷酸序列是該計(jì)劃的核心 。 1977年 Sanger發(fā)明了以雙脫氧核苷三磷酸 （ 2’3’ddNTPs） 作為 DNA合成終止劑的 “ 末端終止法 ” ， 開創(chuàng)了基因核苷酸序列測(cè)定的先河 ， 最早完成了 Φ 174全部序列的測(cè)定 。 為此 Sanger第二次獲得諾貝爾獎(jiǎng) 。 發(fā)現(xiàn)了重疊基因 Sanger等最早對(duì) Φ 174病毒作 DNA序列分析 ， 該病毒基因組全長(zhǎng) 5400bp， 共編碼 9種蛋白質(zhì) ， 但根據(jù)該 9種蛋白質(zhì)分子量推算其編碼區(qū) ， 明顯超過(guò)病毒基因組5400bp長(zhǎng)的核苷酸所能編碼的容量 。 如何解開這個(gè)謎 ？ Sanger回答了這個(gè)問(wèn)題： 在基因組中存在重疊基因 ！ 重疊基因 定義：在一種蛋白質(zhì)的核苷酸編碼序列中包含了另一種蛋白質(zhì)的編碼序列，所不同的是各自以不同的讀碼框轉(zhuǎn)譯。 Φ 174病毒的重疊基因如下： A B C D J F G H E 重疊基因概念與密碼子的非重疊性 Sanger采用獨(dú)創(chuàng)的序列分析方法對(duì) Φ 174病毒基因組作序列分析，提出了令世人驚訝的重疊基因概念，是對(duì)基因認(rèn)識(shí)的重大發(fā)展。 重疊基因是利用兩種不同的讀碼框架編碼兩種不同的蛋白質(zhì)，在每一讀碼框中密碼子解讀仍是不重疊的。 如下圖： aa1 aa2 3 59 60 61 62 63 149 150 151 152 ↑ ATG AGT CAA …… GTT TAT GGT ACG CTG ……GAA GGA GTG ATG TAA 175 189 445 aa1 aa2 3 4 89 90 ↓ 基因 E開始 基因 E終止 ↑ 基因 D開始 基因 D終止 Sanger序列分析方法原理 采用單鏈 DNA（ 或?qū)⒑型庠椿虻闹亟M質(zhì)粒 DNA變性 ） ， 在引物和 DNA聚合酶的作用下 ， 在四組獨(dú)立的反應(yīng)中除加有 4種 dNTPs外 （ 其中之一為同位素標(biāo)記 ） ， 再分別加入 4種 ddNTPs中的一種作為鏈延伸的終止劑 ， 結(jié)果將在四組反應(yīng)管中產(chǎn)生長(zhǎng)度不等的 4組寡核苷酸鏈 ， 它們分別終止于被測(cè)鏈的每一個(gè) A、 G、 C或 T。 如在加有 ddATP的反應(yīng)管中產(chǎn)生的是一系列以 A為結(jié)尾的寡核苷酸鏈；在加有 ddGTP的反應(yīng)管中形成的是以 G為結(jié)尾一組寡核苷酸鏈等等 ， 再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 轉(zhuǎn)膜和放射自顯影即可從放射自顯影膠片上讀出 DNA序