【正文】 * 新規(guī)模條件下產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性研究； * 根據(jù)情況進行適當(dāng)?shù)呐R床試驗。應(yīng)證明聯(lián)合后的疫苗在安全性和有效性方面至少與單價疫苗是相等的。同時，還應(yīng)評價制品的再懸浮的影響，以及容器和瓶塞與聯(lián)合疫苗是否相匹配。聯(lián)合疫苗的有效期的開始時間應(yīng)當(dāng)是從測定聯(lián)合疫苗中的第一個組分的最后一次有效的效力試驗開始（或合格）之日。 三、聯(lián)合疫苗檢定中應(yīng)考慮的問題 （一）一般要求 對生產(chǎn)的每一批制品都要進行檢測，證明其質(zhì)量達(dá)到了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證制品在安全、純度和效 力方面的質(zhì)量。最好是用動物試驗比較聯(lián)合疫苗與單個抗原的免疫應(yīng)答情況，以確定是否發(fā)生了免疫應(yīng)答的增強或抑制現(xiàn)象。對含有殘余抗生素、含有未曾使用過的防腐劑或含有顆粒狀佐劑的制品，對其半成品和成品的無菌試驗應(yīng)進行研究，并建立適宜于這些制品的無菌 試驗方法。 臨床試驗中應(yīng)觀察接種后的不良反應(yīng)，還應(yīng)進行跟蹤研究，應(yīng)在臨床研究開始前確定不良反應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)和跟蹤研究方案。一般來講，抗體水平和血清陽轉(zhuǎn)對于臨床保護性只起一定的參考作用。對所使用的疫苗批間的差異要進行分析。 如果聯(lián)合疫苗中的單組分疫苗的保護性效力是經(jīng)過證實的，這一研究結(jié)果可以作為參考資料來支持聯(lián)合疫苗的研發(fā)。如果臨床試驗的判定終點是以該疫苗所預(yù)防的各型疾病發(fā)病率的總和時，該試驗應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)囊?guī)模，即確保發(fā)病率低的血清型仍能有一定數(shù)量人群的數(shù)據(jù)，以評價其有效性。為了證明發(fā)生率和比例相同或等價時，采用單側(cè)檢驗是適宜的，因臨床試驗的目的在于證明注射聯(lián)合疫苗與分別注射的單價 組分疫苗無明顯差異。如果已經(jīng)建立了保護性免疫的替代指標(biāo)，在評價聯(lián)合疫苗和分別注射的單價組分疫苗間的差別時，就應(yīng)當(dāng)考慮保護性免疫替代指標(biāo)。因此，不能簡單地采用一種固定的模式研究聯(lián)合疫苗的安全性和有效性。同時，對每個方案中各個階段的操作過程、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并予嚴(yán)格實施。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應(yīng)，每一循環(huán)生成一個新肽鍵。目前多應(yīng)用固相法，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑。 1．主要肽順序與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相同，例如，目標(biāo)氨基酸按需要的順序排列；修飾（脂化及糖基化）情況； 2．對肽單體中的主要雜質(zhì)（可能情況下對次要雜質(zhì)）應(yīng)分離鑒定。目標(biāo)人群中的一部分可能對某一載體存在過敏反應(yīng)或某些載體有刺激自身免疫的危險，應(yīng)避免選擇這些載體。傳統(tǒng)佐劑是在礦物膠基礎(chǔ)上制成 氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣，到目前為止批準(zhǔn)使用的佐劑鮮為他類。 （十二）穩(wěn)定性 進行充分的穩(wěn)定性研究是研制疫苗的一項重要內(nèi)容。但是在合適情況下應(yīng)包括有關(guān)疫苗功能的適宜試驗。 （九） 佐劑、保護劑及其他添加成分：如果使用鋁或鈣的化合物作為佐劑，其用量不應(yīng)超過常規(guī)用量范圍（每人用劑量的鋁佐劑含量應(yīng)不超過 ，鈣佐劑含量應(yīng)不超過 g）。也應(yīng)考慮由聚合或偶合而產(chǎn)生的作用的可能性。 結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則 前 言 結(jié)合（以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類）疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖 蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如 b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合 疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等。應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。 培養(yǎng)基成分應(yīng)盡可能避免使用動物源性材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。應(yīng)采用適宜的方法檢測化學(xué)修飾的效果 , 即活化度測定；另外，可采用凝膠過濾或高效液相色譜等適宜方法測定活化后多糖的分子大小分布，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應(yīng)的批間一致性。 可采用血清學(xué)方法進行載體蛋白的鑒別 試驗。可直接測定游離多糖的含量，或先將結(jié)合多糖和未結(jié)合多糖分離后測定結(jié)合多糖的含量。所加入的防腐劑及其含量應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定，即應(yīng)不破壞疫苗的免疫效果，也 不會損害人體健康； 8．異常毒性試驗，應(yīng)符合現(xiàn)行版《 中國藥典》的要求； 9． pH 值測定： pH 值對結(jié)合疫苗的穩(wěn)定性 、安全性及免疫保護效果影響很大，應(yīng)根據(jù)臨床研究和穩(wěn)定性試驗的結(jié)果確定最適 pH 值范圍。 二、結(jié)合疫苗的臨床研究 為評價結(jié)合疫苗的安全性和免疫原性，應(yīng)按國家規(guī)定的要求進行結(jié)合疫苗的臨床研究。 應(yīng)采用適宜的血清學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評估結(jié)合疫苗的免疫保護效果，應(yīng)對測定 IgG 抗體所采用的方法進行標(biāo)準(zhǔn)化，從而驗證其功能抗體與 IgG 抗體的相關(guān)性，此外，還可通過臨床研究，證明結(jié)合疫苗能誘導(dǎo)多糖疫苗無法誘導(dǎo)的免疫記憶反應(yīng)。 預(yù)防性疫苗的臨床試驗研究者必須適時、全面、客觀而準(zhǔn)確地記錄所有安全性觀察值及相關(guān)數(shù)據(jù)，從而進行不良事件或不良反應(yīng)的評價，注冊申請人必須監(jiān)測臨床研究的全程進展，本不良反應(yīng)的分級標(biāo)準(zhǔn)有助于進行安全性監(jiān)控，并及時做出判斷和按要求適時報告。 表 3 全身反應(yīng)分級表 全身反應(yīng) 輕度（ 1 級） 中度（ 2 級） 嚴(yán)重（ 3 級） 潛在的生命危脅（ 4 級） 變態(tài)反應(yīng) 瘙癢無皮疹 局部蕁麻疹 廣泛蕁麻疹，血管性水腫 嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng) 頭痛 不影響活動，無需治療 一過性，稍有影響活動，需治療（多次使用非麻醉性止痛藥） 嚴(yán)重影響日?；顒?，初始麻醉劑治療有反應(yīng) 頑固性，重復(fù)麻醉劑治療。 （一）不良反應(yīng)分級表 1．臨床觀察指標(biāo)（表 1～ 3） 表 1 局部反應(yīng)分級表 局部反應(yīng) 輕度（ 1 級） 中度（ 2 級） 嚴(yán)重（ 3 級） 潛在的生命危脅（ 4 級） 疼痛 不影響活動 影響活動或多次使用非麻醉性止痛藥 影響日?；顒踊蚨啻问褂寐樽硇灾雇此? 急診或住院 皮膚粘膜 紅，瘙癢 彌散，斑丘疹樣皮疹，干，脫屑 泡狀，潮濕，脫屑或潰瘍 脫皮性皮炎，累及粘膜，或多型性紅斑，或疑似 StevensJohnsons 綜合癥 硬結(jié) * 15 mm 15～ 30 mm 30 mm 壞疽或剝脫性皮炎 紅 * 15 mm 15～ 30 mm 30 mm 壞疽或剝脫性皮炎 腫 ** 15 mm 且不影響活動 15～ 30 mm 或影響活動 30 mm 或限制日常活動 壞疽 疹（注射部位） 15 mm 15～ 30 mm 30 mm 瘙癢 注射部位微癢 注射肢中度癢 全身癢 *除了最直接地通過測量直徑來分級評價局部反 應(yīng)，還要記錄測量結(jié)果的發(fā)展變化。同時，本指導(dǎo)原則提供的統(tǒng)一不良反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)也有助于預(yù)防性疫苗的同一臨床試驗不同試驗組間或不同臨床試驗間的安全性數(shù)據(jù)的比較。 必要時，結(jié)合疫苗 的臨床研究中可設(shè)置多糖疫苗對照組。加速穩(wěn)定性試驗的結(jié)果不能替代實時穩(wěn)定性試驗。如果所使用的佐劑為鋁佐劑，每人用劑量中的佐劑含量應(yīng)不超過 ； 7．防腐劑含量：選擇防腐劑時應(yīng)該考慮防腐劑的穩(wěn)定性，應(yīng)避免選擇可能與疫苗成分產(chǎn)生相互作用的防腐劑。此外，還應(yīng)對純化后的多糖 蛋白結(jié)合物進行以下檢測： 1．應(yīng)采用適宜的檢測方法，確證多糖 蛋白結(jié)合物原液經(jīng)過純化后，多糖 蛋白結(jié)合反應(yīng)中所使用的試劑（如溴化氰、 ADH 和 EDAC 等化學(xué)試劑）已被清除； 2．如果化學(xué)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生了獨特的結(jié)合標(biāo)志（例如某一獨特的氨基酸），可通過測定該標(biāo)志物定量分析多糖 —蛋白結(jié)合反應(yīng)的程度，也可將結(jié)合物中多糖 /蛋白比作為判斷結(jié)合反應(yīng)的一個間接標(biāo)志； 3．殘留的活化功能基團：結(jié)合物中多糖或載體蛋白均應(yīng)不再殘留有 活化后未結(jié)合的功能基團； 4．結(jié)合及未被結(jié)合的多糖含量：結(jié)合多糖為結(jié)合疫苗中的免疫保護抗原。（ 2）可采用 SDSPAGE 圖譜分析測定純化后 B 群腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物的組成；其脂多糖的含量不應(yīng)超過 8%；家兔熱原試驗應(yīng)合格。通常應(yīng)在－ 20℃ 以下儲存精制純化后的多糖，以維持其穩(wěn)定性。如：形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)和血清學(xué)試驗等。必須制訂詳細(xì)的和切實可行的緊急處理措施，確保一旦發(fā)生細(xì)菌溢出、滲漏等其它細(xì)菌播散 事故時，可最大限度地控制和避免危害人身和環(huán)境的安全。毫 無疑問安全試驗是必要的，但選擇何種試驗則應(yīng)依靠實際情況而定，并應(yīng)咨詢有關(guān)質(zhì)控當(dāng)局。 必須確保使用的肽序列不具有明顯的不良藥理活性。 （七）生物效價測定 （八）建立內(nèi)部參考品：建立適當(dāng)?shù)膮⒖计穼崿F(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)也是必要的。 （二）理化性質(zhì)均一性的確定：氨基酸序列分析（ N/C 末端）、肽圖、 MS 以及氨基酸組成（ AAA）分析。 如果在疫苗中加入防腐劑，應(yīng)確定其含量，該用量應(yīng)既不對疫苗中的各個成分產(chǎn)生不良作用，也不應(yīng)引起人體副反應(yīng)。這些成分其特性變化較大，從小分子物質(zhì)到大分子菌體成分及合成聚合物等各不相同，有作為非特異免疫 增強劑的成分，特異性免疫激活作用的成分及直接作用于不同免疫細(xì)胞的成分。 （八）偶聯(lián)物 偶聯(lián)物中多肽及其它成分除了達(dá)到適當(dāng)?shù)囊笸?，還應(yīng)符合下列規(guī)定： 1．對偶聯(lián)物進行驗證，其含量應(yīng)能重復(fù)并保持一致，當(dāng)不止一種肽結(jié)合到同一載體上時，應(yīng)對每一種肽所占比例進行控制并能 重復(fù)制備； 2．最大限度降低副反應(yīng)并控制到能重復(fù)的水平，這些副反應(yīng)包括載體之間的交聯(lián)，載體表面濃縮的未結(jié)合的偶聯(lián)劑，以及對未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑的滅活等； 3．有證據(jù)表明偶聯(lián)物未改變抗原序列； 4．應(yīng)當(dāng)考慮機體對載體蛋白或其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛在臨床影響； 5．當(dāng)同一載體用于幾種疫苗或一種疫苗的幾種不同表位時，應(yīng)考慮特異性表位抑制的可能性，并進行調(diào)查； 6．應(yīng)當(dāng)最大限度地降低殘余溶劑或副產(chǎn)品的含量，并設(shè)定相應(yīng)限定要求； 7．應(yīng)當(dāng)設(shè)定適宜的可接受的標(biāo)準(zhǔn)，合適的參考制品可能是必要的。如果采用了液體合成法，應(yīng)當(dāng)提供包括對中間體有特殊說明的流程圖。 另外也引入一些新進展包括改良的保護基因、新的固相載體、脫保護及側(cè)鏈功基保護等新方法。這些側(cè)鏈保護基團必須能耐受除去 α－氨基保護基團的條件，這樣才能生成新的氨基基團使肽鏈得以繼續(xù)延長。多肽作為體內(nèi)引起效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答形成的免疫原，將成為一種新型的疫苗，但還有很多理論和技術(shù)問題要繼續(xù)研究，目前尚無多肽疫苗獲準(zhǔn)上市。 總之，聯(lián)合疫苗的研發(fā)和臨床試驗不同于一般疫苗，除一般要求以外，還應(yīng)充分考慮多種組分聯(lián)合后產(chǎn)生的相互作用對聯(lián)合后疫苗的安全性和有效性的影響，以及是否產(chǎn)生毒性逆轉(zhuǎn)或重組。 臨床結(jié)果分析時，應(yīng)同時進行血清的陽轉(zhuǎn)率與抗體滴度的分析比較研究。按照受試者的特性（如：年齡或者到達(dá)試驗點的日期）分組的方法不符合隨機分配的原則。因此可采用相應(yīng)的替代方案。如果一個免疫學(xué)的保護性相關(guān)指標(biāo)在能夠確定質(zhì)和量的相互關(guān)系時，就可以代替流行病學(xué)指標(biāo)。 用于臨床驗證的制品批數(shù)可 以比用于生產(chǎn)一致性研究的批數(shù)少。在臨床試驗方案中應(yīng)包含各組分免 疫原性與其保護性之間關(guān)系研究的要求。 （一）安全性研究 一般來講，聯(lián)合疫苗的安全性研究是與同時在不同部位接種聯(lián)合疫苗中的每一種單價組分疫苗進行比較，例如，接種 DTPHB 疫苗與分別接種 DTP 和 HB 疫苗進行比較。 （三）鑒別試驗 應(yīng)對聯(lián)合疫苗中每一活性組分進行檢定，目的是證明制品的內(nèi)容物與其標(biāo)簽的標(biāo)示相一致。效力試驗應(yīng)能證實組分間的相互作用使某一種組分對其他組分產(chǎn)生增強或減弱作用。可采用下述聯(lián)合配比方法的距陣表或采用隨機采樣法，例如： X、 Y、 Z 等組分配制的聯(lián)合疫苗可采用每一組分的第一批聯(lián)合后得到成品為第一批，即 X1+Y1+Z1+...N1 配制得到最終成品為批號 1， X2+Y2+Z2+...N2 配制得到最終成品為批號2， X3+Y3+Z3+...N3 配制得到最終成品為批號 3。 （五）穩(wěn)定性和有效期 在穩(wěn)定性和有效期的研究時，應(yīng)使用三批成品考核實際貯存時間內(nèi)制品的穩(wěn)定性，以制定該制品的有效期。還應(yīng)當(dāng)考慮到聯(lián)合疫苗中的每一組分都有可能通過聯(lián)合使毒力回復(fù)。本指導(dǎo)原則亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗積累而逐步完善。 7．分離、純化方法的變更 * 變更說明； * 驗證資料； * 變更前、后主要有效成分生物學(xué)變化的研究； * 變更前、后連續(xù) 3 批產(chǎn)品質(zhì)量分析資料，包括生產(chǎn)各關(guān)鍵階段中間產(chǎn)品、原液及終產(chǎn)品的分析、檢測及穩(wěn)定性研究資料； * 應(yīng)進行適當(dāng)?shù)呐R床試驗。詳見下表。 生物制品生產(chǎn)工藝過程變更管理技術(shù)指導(dǎo)原則 前 言 本指導(dǎo)原則適用于已經(jīng)取得生產(chǎn)文號的生物制品生產(chǎn)過程等發(fā)生變更的管理技術(shù)指導(dǎo)原則，所指生物制品生產(chǎn)過程變更是指生產(chǎn)者對已獲國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的生產(chǎn)全過程中的任何過程所進行的任何變動。 11．效力試驗（生物效價）：由于用于預(yù)防的疫苗是通過機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生作用的，因此應(yīng)評價其體液免疫和細(xì)胞免疫的生物效價。疫苗中殘余宿主細(xì)胞 DNA 及蛋白殘留量可參考現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。若無法建立動物模型，應(yīng)建立能驗證該疫苗有效性的體外實驗進行評價。如疫苗的抗原能滿足免疫的需要，則不加佐劑為宜。該驗證方法可采用 PERT 法； （ 4）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗證要求可參考《 IABS Scientific workshop on neurovirulence test for live virus