【正文】 要求外，還應符合下列規(guī)定： 1．對偶聯(lián)物進行驗證，其含量應能重復并保持一致，當不止一種肽結(jié)合到同一載體上時，應對每一種肽所占比例進行控制并能 重復制備； 2．最大限度降低副反應并控制到能重復的水平，這些副反應包括載體之間的交聯(lián)，載體表面濃縮的未結(jié)合的偶聯(lián)劑，以及對未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑的滅活等； 3．有證據(jù)表明偶聯(lián)物未改變抗原序列； 4．應當考慮機體對載體蛋白或其誘導免疫反應的潛在臨床影響； 5．當同一載體用于幾種疫苗或一種疫苗的幾種不同表位時，應考慮特異性表位抑制的可能性，并進行調(diào)查； 6．應當最大限度地降低殘余溶劑或副產(chǎn)品的含量，并設定相應限定要求； 7．應當設定適宜的可接受的標準，合適的參考制品可能是必要的。例如，聚合體和脂多糖應當具有可重復的分子量范圍，脂多糖具有一致的單糖組分，脂質(zhì)體具有一致的結(jié)構(gòu)、組分。這些成分其特性變化較大，從小分子物質(zhì)到大分子菌體成分及合成聚合物等各不相同，有作為非特異免疫 增強劑的成分，特異性免疫激活作用的成分及直接作用于不同免疫細胞的成分。由于滅菌可能會改變佐劑的結(jié)合特征，對不同批次佐劑應以可重復、持續(xù)的方式處理。 如果在疫苗中加入防腐劑，應確定其含量，該用量應既不對疫苗中的各個成分產(chǎn)生不良作用，也不應引起人體副反應。為確保每種成分的有效性，應對到期產(chǎn)品的免疫原性及安全性進行實時穩(wěn)定性研究。 （二）理化性質(zhì)均一性的確定：氨基酸序列分析（ N/C 末端）、肽圖、 MS 以及氨基酸組成（ AAA）分析。因此應考慮活體外及活體內(nèi)免疫性和抗原性測定試驗。 （七）生物效價測定 （八）建立內(nèi)部參考品：建立適當?shù)膮⒖计穼崿F(xiàn)這些標準也是必要的。 四、臨床前安全評價 臨床前安全評價的主要目的是確定新藥制品是否引起意外或不良的效應。 必須確保使用的肽序列不具有明顯的不良藥理活性。因此，應全面檢查多肽及其偶合物的藥理活性。毫 無疑問安全試驗是必要的，但選擇何種試驗則應依靠實際情況而定，并應咨詢有關質(zhì)控當局。其制造及檢定方法的標準操作規(guī)范、驗證和修訂應獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準或認可。必須制訂詳細的和切實可行的緊急處理措施，確保一旦發(fā)生細菌溢出、滲漏等其它細菌播散 事故時，可最大限度地控制和避免危害人身和環(huán)境的安全。從主種子批制備工作種子批。如：形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化反應和血清學試驗等。 應在培養(yǎng)過程中及殺菌前取樣進行純菌試驗，可采用革蘭氏染色鏡檢和平皿劃線接種培養(yǎng)等。通常應在－ 20℃ 以下儲存精制純化后的多糖，以維持其穩(wěn)定性。 結(jié)合疫苗常用的載體蛋白包括有：破傷風類毒素、白喉毒素無毒變異蛋白（ CRM197）和 B 群腦膜炎球菌外膜蛋白等。（ 2）可采用 SDSPAGE 圖譜分析測定純化后 B 群腦膜炎球菌外膜蛋白復合物的組成；其脂多糖的含量不應超過 8%；家兔熱原試驗應合格。 如果載體蛋白與多糖結(jié)合前需進行活化處理，應建立測定蛋白活化程度的方法，以確保批與批之間的一致性。此外，還應對純化后的多糖 蛋白結(jié)合物進行以下檢測： 1．應采用適宜的檢測方法，確證多糖 蛋白結(jié)合物原液經(jīng)過純化后，多糖 蛋白結(jié)合反應中所使用的試劑（如溴化氰、 ADH 和 EDAC 等化學試劑）已被清除； 2．如果化學結(jié)合反應產(chǎn)生了獨特的結(jié)合標志（例如某一獨特的氨基酸），可通過測定該標志物定量分析多糖 —蛋白結(jié)合反應的程度，也可將結(jié)合物中多糖 /蛋白比作為判斷結(jié)合反應的一個間接標志； 3．殘留的活化功能基團：結(jié)合物中多糖或載體蛋白均應不再殘留有 活化后未結(jié)合的功能基團； 4．結(jié)合及未被結(jié)合的多糖含量：結(jié)合多糖為結(jié)合疫苗中的免疫保護抗原。 疫苗原液在稀釋、分裝前可加入適宜和適量的佐劑、防腐劑及保護劑。如果所使用的佐劑為鋁佐劑，每人用劑量中的佐劑含量應不超過 ； 7．防腐劑含量：選擇防腐劑時應該考慮防腐劑的穩(wěn)定性，應避免選擇可能與疫苗成分產(chǎn)生相互作用的防腐劑。必須采用疫苗生產(chǎn)廠家提供的、符合國家規(guī)定的稀釋劑。加速穩(wěn)定性試驗的結(jié)果不能替代實時穩(wěn)定性試驗。因此，多價結(jié)合疫苗宜采用多批疫苗進行臨床研究。 必要時，結(jié)合疫苗 的臨床研究中可設置多糖疫苗對照組。大多 數(shù)預防性疫苗的各階段臨床試驗均選擇健康的受試者，并且多數(shù)疫苗用于健康兒童，因此，在預防性疫苗臨床研究過程中，對安全性方面的考慮尤為重要，其要求應高于一般治療性藥物。同時，本指導原則提供的統(tǒng)一不良反應分級標準也有助于預防性疫苗的同一臨床試驗不同試驗組間或不同臨床試驗間的安全性數(shù)據(jù)的比較。 二、基本內(nèi)容 本指導原則提供的預防性疫苗臨床試驗中不良反應的分級指標包括兩部分（詳見毒性分級表），第一部分為臨床指標（局部反應、全身反應、生命體征檢測）；第二部分為實驗室指標（血生化、血常規(guī)、尿常規(guī)檢測），但并非涵蓋所有預防性疫苗臨床試驗中所需觀察的安全性指標，對于一些開發(fā)中的特殊疫苗可能需要增加額外的監(jiān)控指標，或修改表中參數(shù)的具體界定值。 （一）不良反應分級表 1．臨床觀察指標（表 1～ 3） 表 1 局部反應分級表 局部反應 輕度（ 1 級） 中度（ 2 級） 嚴重（ 3 級） 潛在的生命危脅（ 4 級） 疼痛 不影響活動 影響活動或多次使用非麻醉性止痛藥 影響日?；顒踊蚨啻问褂寐樽硇灾雇此? 急診或住院 皮膚粘膜 紅，瘙癢 彌散，斑丘疹樣皮疹，干，脫屑 泡狀，潮濕，脫屑或潰瘍 脫皮性皮炎，累及粘膜，或多型性紅斑，或疑似 StevensJohnsons 綜合癥 硬結(jié) * 15 mm 15～ 30 mm 30 mm 壞疽或剝脫性皮炎 紅 * 15 mm 15～ 30 mm 30 mm 壞疽或剝脫性皮炎 腫 ** 15 mm 且不影響活動 15～ 30 mm 或影響活動 30 mm 或限制日?；顒? 壞疽 疹（注射部位） 15 mm 15～ 30 mm 30 mm 瘙癢 注射部位微癢 注射肢中度癢 全身癢 *除了最直接地通過測量直徑來分級評價局部反 應，還要記錄測量結(jié)果的發(fā)展變化。 表 4 血生化指標分級表 血清 輕度（ 1 級） 中度（ 2 級） 嚴重（ 3 級） 潛在的生命危脅（ 4 級） 肝功能－ ALT,AST 由影響因素引起的升高 ～ ULN* ～ 5 ULN ～ 10 ULN 10ULN 肌酐 ～ ULN ～ ULN ～ 6ULN 6ULN BUN ～ ULN ～ 5ULN ～ 10ULN 10ULN 膽紅素 :由影響因素引起的升高但功能檢查正常 ～ ULN ～ ULN ～ ULN ULN 膽紅素 :由影響因素引起 ～ UL ～ UL ～ UL ULN 的升高伴隨肝功能檢查指標的升高 N N N 胰酶 淀粉酶，脂肪酶 ～ ULN ～ ULN ～ ULN ULN。 表 3 全身反應分級表 全身反應 輕度（ 1 級） 中度（ 2 級） 嚴重（ 3 級） 潛在的生命危脅（ 4 級） 變態(tài)反應 瘙癢無皮疹 局部蕁麻疹 廣泛蕁麻疹，血管性水腫 嚴重變態(tài)反應 頭痛 不影響活動，無需治療 一過性，稍有影響活動，需治療（多次使用非麻醉性止痛藥） 嚴重影響日?；顒樱跏悸樽韯┲委熡蟹磻? 頑固性，重復麻醉劑治療。 不同疫苗在進行臨床試驗時，可根據(jù)疫苗的特性，從本文的不良反應分級表中選擇適合的觀察指標。 預防性疫苗的臨床試驗研究者必須適時、全面、客觀而準確地記錄所有安全性觀察值及相關數(shù)據(jù)，從而進行不良事件或不良反應的評價，注冊申請人必須監(jiān)測臨床研究的全程進展，本不良反應的分級標準有助于進行安全性監(jiān)控，并及時做出判斷和按要求適時報告。本指導原則針對預防性疫苗制定不良反應分級標準的目的，就是最大程度地降低健康受試者在臨床試驗中的風險，本不良反應分級標準中所采 用參數(shù)的界定值，系基于已上市疫苗臨床試驗中所獲得的經(jīng)驗和已公開的信息，并結(jié)合當前國情的考慮。 應采用適宜的血清學標準評估結(jié)合疫苗的免疫保護效果，應對測定 IgG 抗體所采用的方法進行標準化，從而驗證其功能抗體與 IgG 抗體的相關性，此外，還可通過臨床研究，證明結(jié)合疫苗能誘導多糖疫苗無法誘導的免疫記憶反應。 如果結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝或劑量、劑型發(fā)生了變化，應及時向國家食品藥品監(jiān)督管理局報告，由國家食品藥品監(jiān)督管理局根據(jù)具體情況組織專家進行再評估，評估的內(nèi)容包括：發(fā)生的變化是否會影響結(jié)合疫苗的質(zhì)量、批間一致性、結(jié)構(gòu)完整性和免疫原性。 二、結(jié)合疫苗的臨床研究 為評價結(jié)合疫苗的安全性和免疫原性，應按國家規(guī)定的要求進行結(jié)合疫苗的臨床研究。 結(jié)合疫苗的標簽上應標明：每一人用劑量中所含多糖抗原（血清群、型別）和載體蛋白；每一人用劑量中每一結(jié)合物的含量； 儲存和運輸?shù)倪m宜溫度（ 28℃ ）；如果疫苗為凍干疫苗，應標明疫苗復溶后應迅速接種；凍干疫苗應標明疫苗復溶所采用的稀釋劑名稱及體積。所加入的防腐劑及其含量應符合國家有關規(guī)定，即應不破壞疫苗的免疫效果，也 不會損害人體健康； 8．異常毒性試驗，應符合現(xiàn)行版《 中國藥典》的要求； 9． pH 值測定： pH 值對結(jié)合疫苗的穩(wěn)定性 、安全性及免疫保護效果影響很大，應根據(jù)臨床研究和穩(wěn)定性試驗的結(jié)果確定最適 pH 值范圍。稀釋分裝前無菌試驗應合格?？芍苯訙y定游離多糖的含量，或先將結(jié)合多糖和未結(jié)合多糖分離后測定結(jié)合多糖的含量。為了確保多糖 蛋白結(jié)合物的穩(wěn)定性、安全性和批間一致性，應建立相應的質(zhì)量控制方法。 可采用血清學方法進行載體蛋白的鑒別 試驗。 采用國外已通過臨床試驗驗證的安全有效的 CRM197 蛋白、 B 群腦膜炎球菌外膜蛋白等作為載體，應參照國外相應的質(zhì)量標準，對其特性和純度進行質(zhì)量復核：（ 1）可采用 HPLC 法等適宜方法 測定 CRM197 蛋白的純度，其純度應在 90% 以上；應確保 CRM197 蛋白的氨基酸序列正確無誤。應采用適宜的方法檢測化學修飾的效果 , 即活化度測定；另外，可采用凝膠過濾或高效液相色譜等適宜方法測定活化后多糖的分子大小分布，以確保多糖－蛋白結(jié)合反應的批間一致性。 2．精制純化多糖：精制純化多糖應逐批進行鑒別試驗、純度和分子大小測定。 培養(yǎng)基成分應盡可能避免使用動物源性材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性材料。工作種子批用于生產(chǎn)。應采用種子批系統(tǒng)。 應根據(jù)疫苗生產(chǎn)用菌種的生物安全防護等級分類，在相應的生物安全防護條件下進行各項生產(chǎn)用菌種的操作。 結(jié)合疫苗質(zhì)量控制和臨床研究技術(shù)指導原則 前 言 結(jié)合（以蛋白為載體的細菌多糖類）疫苗是指采用化學方法將多糖共價結(jié)合在蛋白載體上所制備成的多糖 蛋白結(jié)合疫苗，用于提高細菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如 b 型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗、腦膜炎球菌結(jié)合 疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗等。因此，應使用人體組織測定疫苗的最后配方及佐劑是否產(chǎn)生意外的交叉抗體。也應考慮由聚合或偶合而產(chǎn)生的作用的可能性。動物毒性試驗會產(chǎn)生種屬特異性方面的問題，因此，多肽疫苗的安全評價應考慮諸多因素。 （九） 佐劑、保護劑及其他添加成分：如果使用鋁或鈣的化合物作為佐劑，其用量不應超過常規(guī)用量范圍（每人用劑量的鋁佐劑含量應不超過 ，鈣佐劑含量應不超過 g）。由于疫苗的作用模式會改變，有關這類試驗的細節(jié)應區(qū)別對待，不能一概而論。但是在合適情況下應包括有關疫苗功能的適宜試驗。應對疫苗生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟的各種成分（無論以單獨或偶聯(lián)方式）均應建立相應的監(jiān)控標準，包括原材料質(zhì)控，加工過程的質(zhì)控和終產(chǎn)品的質(zhì)控，以保證終產(chǎn)品安全有效。 （十二）穩(wěn)定性 進行充分的穩(wěn)定性研究是研制疫苗的一項重要內(nèi)容。每種成分應具有 適當?shù)姆治鰳藴室螅K配方中應限定不同成分混合物的含量。傳統(tǒng)佐劑是在礦物膠基礎上制成 氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣，到目前為止批準使用的佐劑鮮為他類。 （十）聚合、烷化或載體合成肽 無論是與聚合肽構(gòu)架（例如 MAP）結(jié)合的肽，或肽單體合成后再進一步形成的聚合肽或烷化肽（例如，通過未端半胱氨酸的氧化作用），也無論是單一肽鏈或與其它肽鏈的聚合，都應有相應的證據(jù)，表明反應過程達到了最后可重復的階段。目標人群中的一部分可能對某一載體存在過敏反應或某些載體有刺激自身免疫的危險，應避免選擇這些載體。 （六）如果不能對肽單體進行全面鑒定，應提供相應說明。 1．主要肽順序與預期的結(jié)構(gòu)相同，例如，目標氨基酸按需要的順序排列；修飾（脂化及糖基化）情況； 2．對肽單體中的主要雜質(zhì)（可能情況下對次要雜質(zhì)）應分離鑒定。 （三） 應當提供肽鏈合成的詳細資料。目前多應用固相法，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑。 在固相合成法是將肽鏈一端結(jié)合于固相載體上的方法。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應，每一循環(huán)生成一個新肽鍵。如果 A氨基酸的 C 端與 B 氨基酸的 N 端縮合產(chǎn)生 2 肽 A－ B，則 A 的 N 端及 B 的 C 端必須保護起