【正文】 的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，單位署名為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)） 題 目： 酵母工程菌 表達(dá) 的幾丁質(zhì)酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究 畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信聲明 本人聲明：所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，論文中引用他人的文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)、圖表、資料均已作明確標(biāo)注，論文中的結(jié)論和成果為本人獨(dú)立完成，真實(shí)可靠，不包含他人成果及已獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)使用過(guò)的材料。本人授權(quán)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù) 據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）。對(duì)本研究提供過(guò)幫助和做出過(guò)貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均已在文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。 涉密論文按學(xué)校規(guī)定處理 。 1 材料與方法 ....................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制 ....................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 N乙酰氨基葡萄糖（ NAG）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 ........ 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 幾丁質(zhì)酶 的酶學(xué)性質(zhì) ........................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE檢測(cè) ........................ 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 幾丁質(zhì)酶的 pH 穩(wěn)定性 ............................ 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 3 結(jié)論與討論 ....................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 致謝 ............................................... 錯(cuò)誤 !未定義書(shū)簽。 Cu2+、 Ag+、 Hg2+ 和 SDS對(duì)酶活 性 有明顯的抑制作用 ， 該酶能特異性降解膠體幾丁質(zhì)。 Chitinase。 然而自然界中的幾丁質(zhì)幾乎以相等的速率產(chǎn)生和消失， 在這個(gè)過(guò)程中 ， 微生物起了非常重要的作用。但由于化學(xué)方法降解幾丁質(zhì)條件苛刻、穩(wěn)定性差、處理繁瑣 、 污染嚴(yán)重，使得無(wú)法對(duì)它的進(jìn)行大規(guī)模開(kāi)發(fā)利用。 1921年 Folpmers發(fā)現(xiàn)分解幾丁質(zhì)的細(xì)菌和放線(xiàn)菌在含幾丁質(zhì)的瓊脂上形成透明圈 ， 從而證明這些培養(yǎng)物內(nèi)有水溶性的幾丁質(zhì)酶存在 [5]。 幾丁質(zhì)酶可以根據(jù)不同的標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)。 幾丁質(zhì)酶應(yīng)用范圍非常廣，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力，對(duì)工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、自然資源的利用、生物防治、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥衛(wèi)生等都具有重要的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。酵母表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)槠渚哂斜容^完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，而受到越來(lái)越多的重視、利用。 試劑 酵母基本氮源（ YNB）、 D生物素 、甘氨酸購(gòu)自 BBI 公司 ； 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 5 （低）購(gòu)自 TaKaRa 公司 ； 幾丁質(zhì)、殼聚糖（ Chitosan）、 N乙酰氨基 葡萄糖購(gòu)自上海生工； 甘油 ， 甲醇， HCl， 95 % 乙醇，冰醋酸，無(wú)水乙醇， NaOH 溶液，苯酚， β 巰基乙醇 ， 甲醇，乙醇，異丙醇，丙三醇；檸檬酸、磷酸二氫鉀、硼酸、巴比妥，硫酸銨， 酵母提取物，胰蛋白胨，丙烯酰胺（ Acr），雙丙烯酰胺（ Bis）， 三羥甲基氨基甲烷（ Tris），十二烷基硫酸鈉（ SDS），過(guò)硫酸銨（ AP）， TEMED，瓊脂，溴酚藍(lán)，考馬斯亮藍(lán) R250， 3,5二硝基水楊酸（ DNS），酒石酸鉀鈉，無(wú)水亞硫酸鈉， L半胱氨酸， K3PO4， GuSO4 ②500B （ % Biotin， 生物素）：將 2 mg 生物素溶于 10 mL 蒸餾水中，過(guò)濾除菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? （ 2）常用培養(yǎng)基的制備 ①BMGY 培養(yǎng)基：稱(chēng)取 5 g 酵母提取物， 10 g 胰蛋白胨，溶于 350 mL 蒸餾水中，高壓滅菌 20 min，然后冷卻至室溫，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、50 mL 10GY 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? ③ 濃縮膠緩沖液：稱(chēng)取 g Tris， 48 mL 1 mol/L HCl，加 100 mL 蒸餾水溶解。 ⑦10 % 過(guò)硫酸銨：稱(chēng)取 1 g 過(guò)硫酸銨，加 10 mL 蒸餾水溶解（現(xiàn)用現(xiàn)配）。 （ 4）膠體幾丁質(zhì)的制備 ① 稱(chēng)取 10 g 片狀幾丁質(zhì)（剪碎）置于 500 mL 三角瓶中，加 100 mL 濃鹽酸浸泡，然后放入 37 ℃ 搖床中至幾丁質(zhì)完全溶解， 4 ℃ 過(guò)夜。 ② 逐步加入 NaOH 溶液（ 20 g 溶于水），不斷攪拌至溶液清澈透明。 ⑥ 將液體儲(chǔ)存于棕色瓶，避光保存 7 d， 備 用。 （ 2）將 BMGY 培養(yǎng) 物 以 5000 r/min 離心 1015 min，回收酵母細(xì)胞，棄掉上清液，將細(xì)胞重懸于 BMMY 培養(yǎng)基中 ，至 OD600值為 （ 約 100~200 ml）。每次取樣 3 mL 于 mL離心管中 20 ℃ 保存。 ③ 取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每試管加入 3 mL 蒸餾水，混勻。 1 mL 膠體幾丁質(zhì)與稀釋的 mL 酶液放于 50 ℃ 水浴保溫 1 h， 上清液中的還原糖 采用 DNS 法測(cè)定。第 7 天 終止發(fā)酵 收集發(fā)酵液。用適量 50 mmol/mL pH TrisHCl 緩沖液溶解，并在 相同緩沖液中透析 23 d，取少量溶液加 BaCl2檢測(cè)是否透析完全。 ②3 % 濃縮膠凝膠液：取 mL 30 % 凝膠儲(chǔ)液， mL 濃縮膠緩沖液， μl 10 % SDS ， mL ddH2O， 15 μL 10 % 過(guò)硫酸銨， 10 μL TEMED ，混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。室溫下放置 2 h，待其完全凝聚。 ④ 將電泳槽與電泳儀相連，電壓保持 100 V 進(jìn)行電泳，至樣品遷移至玻璃板下端 1 cm 時(shí)停止電泳。 ④ 脫色后，將膠板置于去離子水中室溫下保存。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適 pH 值 10 用廣泛 pH緩沖液將酶反應(yīng)體系 pH 值調(diào)為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性。 幾丁質(zhì)酶的 pH 值穩(wěn)定性 將酶液分別在 pH 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 的緩沖液中 處理 1 h 后，然后再將反應(yīng)體系的 pH值調(diào)至 ，測(cè)定剩余的酶活性。 幾丁質(zhì)酶底物特異性測(cè)定 11 用幾丁質(zhì) 酶液分別水解 2 %的不同底物（膠體幾丁質(zhì)、粉狀幾丁質(zhì)、殼聚糖），每組做三個(gè)重復(fù)， DNS 法測(cè)定幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的水解活性。 因此，選取第 7天的 發(fā)酵 液進(jìn)行酶 學(xué)性質(zhì)研究 。 圖 3 酵母工程菌表達(dá)幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 分析 純：純化后幾丁質(zhì)酶酶液； M：標(biāo)準(zhǔn)分子量 蛋白（低）； 17： 17 天的粗酶液； CK：轉(zhuǎn)pPIC9K 空載體的畢赤酵母 GS115 菌株的表達(dá)產(chǎn)物 Fig. 3 SDSPAGE analysis of expression chitinase from GStachit1K Pure: enzyme solution of purified chitinase。當(dāng)溫度超過(guò) 60 ℃ 時(shí)，酶活性降低，在 80 ℃ 時(shí)， 酶 活性 降 低 至 30 %。 14 0204060801000 10 20 30 40 50 60時(shí)間（ min ）相對(duì)酶活（%）30 ℃35 ℃40 ℃45 ℃50 ℃55 ℃ 圖 6 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性 Fig. 6 The thermostability of chitinase 幾丁質(zhì)酶的 pH 穩(wěn)定性 幾丁質(zhì)酶的 pH 穩(wěn)定性 測(cè)定 結(jié)果如圖 7， 在 pH 之間酶穩(wěn)定 ， 最適 pH值為 。 其中， Cu2+、 Ag+、 Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶的 抑制作用 明顯 。 表 2 各種試劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響 Tab. 2 Effects of different regents on chitinase activity 試劑 濃度 相對(duì)酶活（ %） 試劑 濃度 相對(duì)酶活（ %） SDS %w/v L半胱氨酸 1mmol/L 1%w/v 5mmol/L 尿素 3mol/L 5% EDTA 1mmol/L 乙醇 1% 10mmol/L 5% β 巰基乙醇 1mmol/L 異丙醇 1% 10mmol/L 5% Na2SO4 1mmol/L 丙三醇 1% 5mmol/L 5% 幾丁質(zhì)酶底物特異性測(cè)定 幾丁質(zhì)酶 底物特異性試驗(yàn)結(jié)果如下表 3，幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)有水解活性，而對(duì)粉末狀幾丁質(zhì)和殼聚糖無(wú)水解活性 ,說(shuō)明該幾丁質(zhì)酶特異性降解 膠體幾丁質(zhì)。 底物特異性試驗(yàn)證明該幾丁質(zhì)酶特異性降解膠體幾丁質(zhì)。 討論 （ 1） 幾丁質(zhì)酶的分子量 微生物幾丁質(zhì)酶 的分子量一般為 10100 KD。 （ 2） 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì) 微生物幾丁質(zhì)酶最適溫度一般在 4050 ℃ ， pH 一般認(rèn)為 在 311之間 ，但絕大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶適于 46 的偏酸性環(huán)境 [14]。 因此，在 應(yīng)用 過(guò)程中應(yīng)給予幾丁質(zhì)酶 35 ℃ 以 下 、 偏酸性環(huán)境 ，這有利于提高酶的水解能力。 理論上， 變性劑、抑制劑 可以使酶的結(jié)構(gòu)改變從而使酶變性失活或者與酶的活性中心結(jié)合降低酶的活性。 綜上所述， 不同 來(lái)源的幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)明顯不同，微生物幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)具有豐富的多樣性。 隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胛⑸锘蛑参飿?gòu)建工程菌，大量獲得幾丁質(zhì)酶已 成為可能。 我的實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室湯偉師姐的幫助下完成，同時(shí)得到了劉露、張軍霞師姐的耐心指導(dǎo)，在此一并表示衷心的感謝。對(duì)本文的研究做 出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式注明并表示感謝。盡我所知，除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本設(shè)計(jì)（論文）不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品成果。 本人愿意按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版，同意學(xué)校保存學(xué)位 論文的印刷本和電子版，或采用影印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存設(shè)計(jì)（論文）；同意學(xué)校在不以營(yíng)利為目的的前提下，建立目錄檢索與閱覽服務(wù)系統(tǒng)，公布設(shè)計(jì)（論文）的部分或全部?jī)?nèi)容，允許他人依法合理使用。本次畢業(yè)設(shè)計(jì)是對(duì)我大學(xué)四年學(xué)習(xí)下來(lái)最好的檢驗(yàn)。 首先，我要特別感謝我的知道郭謙功老師對(duì)我的悉心指導(dǎo)，在我的論文書(shū)寫(xiě)及設(shè)計(jì)過(guò)程中給了我大量的幫助和指導(dǎo)，為我理清了設(shè)計(jì)思路和操作方法，并對(duì)我所做的課題提出了有效的改進(jìn)方案。 其次，我要感謝大學(xué)四年中所有的任課老師和輔導(dǎo)員在學(xué)習(xí)期間對(duì)我的嚴(yán)格要求，感謝他們對(duì)我學(xué)習(xí)上和生活上的幫助，使我了解了許多專(zhuān)業(yè)知識(shí)和為人的道理，能夠在今后的生活道路上有繼續(xù)奮斗的力量。從這里走出，對(duì)我的人生來(lái)說(shuō)，將是踏上一個(gè)新的征程，要把所學(xué)的知識(shí)應(yīng)用到實(shí)際工作中去。四年的風(fēng)風(fēng)雨雨，我們一同走過(guò)，充滿(mǎn)著關(guān)愛(ài)，給我留下了值得珍藏的最美好的記憶。老師們認(rèn)真負(fù)責(zé)的工作態(tài)度，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神和深厚的理論水平都使我