【正文】 當(dāng) 篩選方法 從眾多轉(zhuǎn)化子菌落中選出含有某一基因的菌落，再進(jìn)行擴(kuò)增，將重組 DNA分離、回收，以獲得目的基因。 從基因組文庫(kù)中篩選 ? 分離組織或細(xì)胞 染色體 DNA，利用限制性?xún)?nèi)切酶將染色體 DNA切割成基因水平的 許多片段 ，其中即含有我們感興趣的基因片段。 三、目的基因的分離與合成 ? 目的基因 （ target gene）又稱(chēng) 外源基因 ，即我們所要研究的感興趣的基因。 人工染色體 ? 前面我們提到過(guò)用粘粒載體可以克隆長(zhǎng)達(dá) 35－ 45kb的外源基因片段 ， 但是還有許多基因過(guò)于龐大 ， 不能作為單一片段克隆于這些載體中 。 ? 目前所用的真核載體大多是所謂 穿梭載體 （ shuttle vector） ， 它既含有原核細(xì)胞的復(fù)制原件 ， 又含有真核細(xì)胞的復(fù)制原件 ， 因此它既可以在原核細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增 ， 也可以在真核細(xì)胞中擴(kuò)增 、 表達(dá) 。能按 λ 噬菌體 DNA分子的同樣方式環(huán)化起來(lái) ， 克隆外源DNA后 ， 經(jīng)體外包裝能高效進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞 。 粘粒載體 （ cosmid vector，又稱(chēng)柯斯質(zhì)粒載體） ? 粘粒載體由 質(zhì)粒 DNA和 λ 噬菌體 DNA兩部分組成 。 ? λ 噬菌體基因組中功能相關(guān)基因集中分布。 ? 因此從培養(yǎng)基上收獲到的含目的基因的 M13單鏈 DNA可直接作為模板進(jìn)行雙脫氧鏈終止法 測(cè)序 和寡核苷酸 定點(diǎn)突變 。 ? M13噬菌體基因組是單鏈環(huán)狀 DNA， 當(dāng)它侵犯宿主菌后 ，在細(xì)菌胞內(nèi)酶的作用下 ， 單鏈 DNA轉(zhuǎn)變成復(fù)制型雙鏈 DNA， 可提取出來(lái)做基因重組 。 ? 目前使用的噬菌體載體主要有 λ噬菌體衍生物載體 、 粘粒載體 和 單鏈 M13噬菌體載體 等。 當(dāng)外源基因插入后 ， LacZ基因被破壞 ， 不能合成完整的 β 半乳糖苷酶 ， 因此不能分解底物 Xgal，菌落成白色 。 另外，較好的載體往往還引入多種用途的 輔助序列 ，如供藍(lán)白斑篩選的 LacZ 基因。 表達(dá)載體 （ expression vector） ， 使插入的目的基因可轉(zhuǎn)錄 、 進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的載體 ， 具有表達(dá)外源基因的能力 。 載體的分類(lèi) ? 一般常用的載體按來(lái)源分有 質(zhì)粒 （ plasmid） 、 噬菌體（ phage） 和病毒 （ virus） 。 ② 具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn) ， 以便目的基因的插入 。 RNA聚合酶 以 DNA為模板合成 RNA。常用于 339。常用于 DNA 3’ 末端的標(biāo)記和填充、 cDNA第二鏈的合成、 DNA測(cè)序。 →339。 磷酸基團(tuán) ，防止載體自身連接環(huán)化；也用于用 32P標(biāo)記 DNA的 539。常用于 DNA 3‘ 末端的標(biāo)記和填充； cDNA第二鏈的合成， DNA測(cè)序。 可分為 DNA聚合酶和 RNA聚合酶兩大類(lèi)。 磷酸基 和 339。 3. 取酶時(shí)量要準(zhǔn)，最后加酶，最好在冰箱里加。 。 同工異源酶 1. 定義：能識(shí)別相同序列但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶 2. 特點(diǎn)： 1）識(shí)別相同順序 2）切割位點(diǎn)的異同 KpnI GGTAC C SstI CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG 同尾酶 有些限制酶識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端，稱(chēng)這些酶為同尾酶。 …CTGCA G…3 ‘ 339。 端突出的粘性末端 。 339。 EcoR I 539。 從 539。 …CAA ▲ TTG…539。 44＝ 25 46＝ 40948＝ 65536 II型酶切割雙鏈 DNA產(chǎn)生 3種不同的切口： ⑴ 在對(duì)稱(chēng)軸中心同時(shí)切割雙鏈 ， 產(chǎn)生 平末端 或稱(chēng) 鈍性末端 （ blint end） ， 如Hpa I： 539。 ? 重組 DNA技術(shù)中常用的是 II型限制性?xún)?nèi)切酶 。 通常有三個(gè) 斜體字母 的縮寫(xiě)表示 。 限制性核酸內(nèi)切酶 ? 限制性核酸內(nèi)切酶是指能識(shí)別 DNA的特殊序列 ， 并在識(shí)別位點(diǎn)或其周?chē)懈铍p鏈 DNA的一類(lèi)酶 。 ? 第一個(gè)用細(xì)菌表達(dá)的用于人類(lèi)的基因重組藥物 —— 人胰島素 上市（ 1979年美國(guó)基因技術(shù)公司） 牛、豬胰島素，免疫反應(yīng) 化學(xué)合成人胰島素基因 插入 ?半乳糖苷酶基因后 融合蛋白 溴化氰水解 混合重建 用酵母細(xì)胞生產(chǎn)乙型肝炎病毒亞單位疫苗 包膜蛋白 核心蛋白 病毒 DNA 乙肝病毒 用基因工程方法制備乙肝表面包膜蛋白為抗原亞單位疫苗無(wú)致病力，很安全、高效。 ⑤ 從篩選出的陽(yáng)性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段 ， 供進(jìn)一步研究使用 。 哺乳動(dòng)物的克?。嚎寺「拍钤趥€(gè)體水平上的應(yīng)用 采用了核質(zhì)分離、細(xì) 胞融合、體外培養(yǎng)及胚胎移植等技術(shù) 主要內(nèi)容 ① 從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中 ， 分離出 目的基因片段 。 實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱(chēng)為 基因工程 （ geic engineering） 。 ? 所謂 克隆 （ clone） 是指通過(guò)無(wú)性繁殖過(guò)程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體 。 ? 1972年，美國(guó)學(xué)者 SV40（一種猴病毒）的 DNA和噬菌體 DNA分別切割，又將兩者接在一起，成功地構(gòu)建了第一個(gè)體外重組的人工 DNA分子。 從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問(wèn)題 DNA mRNA 蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 tRNA， rRNA 逆轉(zhuǎn)錄 復(fù)制 這些都為基因工程的誕生奠定了堅(jiān)實(shí)的 理論基礎(chǔ) 基因工程的誕生 ? 70年代初， DNA限制性?xún)?nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和一整套 DNA體外重組技術(shù)又為基因工程的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。 基本概念 ? 基因工程的核心是 重組 DNA技術(shù) （ rebinant D N A t e c h n i q u e ） ， 又叫 D N A 克隆 （ D N A cloning） 。 由于研究對(duì)象常常是特異的基因片段 ， 所以又稱(chēng)作 基因克隆 （ gene cloning） 。 細(xì)胞克隆技術(shù)： 在制備單克隆抗體的 B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中運(yùn)用的最為充分。 ④ 篩選出獲得了重組 DNA分子的 受體細(xì)胞克隆 。 利用大腸桿菌（ )、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)人類(lèi)所需要的，從其他方法又難以大量獲得的 重組蛋白質(zhì) 。 常分為 限制性 核 酸 內(nèi) 切 酶 （ r e s t r i c t i o n endonuclease） 、 連接酶 （ ligase） 和 核酸修飾酶 （ modifying enzyme） 。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 ? 命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定 。 限制酶的分類(lèi)及特點(diǎn) ? 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割 DNA方式不同，可分為 I、 II、 III型。識(shí)別序列的大小決定其切割DNA后產(chǎn)生的片段的長(zhǎng)短。 …GTT AAC…3 ‘ 339。 ⑵ 在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)位點(diǎn)分別切割一條鏈 。 … G▼ AATT C… 339。 … C TTAA▲ G… 539。 端切割產(chǎn)生 339。 Pst I 539。 …G ACGTC… 539。 gDNA） 低離子強(qiáng)度： 25mmol/L 高 pH值： pH 8 含有機(jī)溶劑：二甲基亞砜、乙醇、乙烯二乙醇等 6 、有 Mn2+、 Cu2+、 Zn2+、 Co2+等非 Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子。 2. 所加酶量不應(yīng)超過(guò) 10％（ RE保存在 50