基于脂蛋白納米載體的小干擾rna靶向遞送方法研究_畢業(yè)論文-wenkub
2023-07-07 10:55:27 本頁面
【正文】 高生長(zhǎng)水平。這些數(shù)據(jù)表明， rHDL納米粒是一種新型、高效的 siRNA載體，因此。即使干擾 RNA靶向特定基因確實(shí) 很 有前 景 的 ，但需要體內(nèi) 高效和生物相容性的 siRNA遞送手段來 實(shí)現(xiàn)其完整的治療潛力。 HDL在膽固醇逆轉(zhuǎn)中起著舉足輕重的作用，通過促進(jìn)外周細(xì)胞多余膽固醇返回到肝臟進(jìn)行消除（膽汁排泄或在肝腸循環(huán)使用）?；隗w積小，屏蔽疏水核心，受體介導(dǎo)的攝取能力等這些有效特征， HDL納米粒是一種理想的藥物載體。 為了研究 siRNA靶向輸送途徑，一些腫瘤細(xì)胞受體已被獲知。例如，乳腺癌細(xì)胞通過增加 SR B1的表達(dá)來增加膽固醇酯的攝取。激活 STAT3是惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和發(fā)展（例 如，細(xì)胞增殖，分化和存活）的關(guān)鍵過程。在卵巢癌患者中， FAK過度表達(dá)與侵襲性腫瘤的特征相關(guān)，這有助于弱勢(shì)細(xì)胞生存。簡(jiǎn)單地說，載脂蛋白 AI ，是 rHDL 納米粒的主要核蛋白，在生產(chǎn)蛋白過程中用質(zhì)粒載體進(jìn)行分離和純化。膽酸鈉， 140μ L （ 100mg/ml 溶于為PBS ）形成的蛋黃卵磷脂摩和膽酸的摩爾比為 1: 。 rHDL/靶向 siRNA 溶液用 ％的生理鹽水稀釋到為。顆粒明顯可見（放大 50000倍），通過使用 Zeiss 910透射型電子顯微鏡。本篇文章中所用到所有細(xì)胞株都是德克薩斯大學(xué) MD 安德森癌癥中心的，通過表征細(xì)胞線芯的研究得到認(rèn)證。所有的細(xì)胞都保存在 37176。 ） ，粘著斑激酶（靶序列 539。 ）均購自 SigmaAldrich 公司 ，RNAiFect 轉(zhuǎn)染試劑按照廠家建議 使用。 RNA 通過提取 (氯仿 ),沉淀 (異丙醇 )和純化 (75%乙醇 )。從微序列分析得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，加載到異丙醇獨(dú)創(chuàng)性通路數(shù)據(jù)庫，關(guān)于凋亡基因的不同表達(dá)可以驗(yàn)證選擇性。肌動(dòng)蛋白作為一個(gè)內(nèi)源性對(duì)照。 C 孵育過夜。流式細(xì)胞儀分析之前的樣品。 高表達(dá) 或低表達(dá)都是 由婦科病理學(xué)家使用下列程序 來決定的 :強(qiáng)度從 1到 3,分布是從 1到 4。 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 siRNA 選擇性 遞送 SKOV3ip1雌性裸鼠用 （每組 n = 3時(shí)）靜脈注射或腹腔注射 。每張幻燈片有十個(gè)高倍區(qū)域，取平均值。適合的腫瘤細(xì)胞來源于卵巢癌小鼠模型（ HeyA8， SKOV3ip1和 HeyA8 MDR ）用腹腔注射接種。兩個(gè)星期后，按照前面描述的開始用奧沙利鉑處理，根據(jù)圖 2C 所示。在非參數(shù)值中 ,連續(xù)變量使用曼 懷氏等級(jí)和檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn) (所有組 )進(jìn)行比較。本研究中所有的數(shù)據(jù)使用雙側(cè)分析。 rHDL 納米粒具有強(qiáng)大的有效載荷承載能力（最高至 4mg siRNA /ml)。在 50種人類卵巢上皮癌 , 96%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)了 SRB1受體 (圖 1 C)。在正常 的組織里，只有肝臟 SRB1高度表達(dá)，而其他組織很少表達(dá)。我們進(jìn)一步驗(yàn)證 rHDL納米粒的遞 送是否由受體介導(dǎo)。 用該方法進(jìn)行長(zhǎng)期治療實(shí)驗(yàn)之前，我們下一個(gè)驗(yàn)證 STAT3 siRNA 偶聯(lián)到rHDL 納米顆粒 (siRNA / rHDL)在體內(nèi)基因沉默的有效性。第四天，單劑量注射 ，我們發(fā)現(xiàn)降低了 88% STAT3蛋白水平 (圖 W3B)，在第 6天，蛋白表達(dá)有些回升。 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 Figure delivery of siRNA using rHDL nanoparticles. (A) Uptake of Alexa555labeled siRNA/rHDL in SKOV3ip1 tumors. A single IV or IP injection of mg/kg of Alexa555 labeled or mg/kg of IV and IP injection of untagged siRNA/rHDL was administered in mice bearing SKOV3ip1 tumors, and 48 hours later, tumors were harvested and counterstained with Hoechst (blue), and siRNA (red) uptake was assessed with fluorescence microscopy. The Hamp。在 HeyA8 模型中，單獨(dú)給 STAT3 siRNA / rHDL 或多烯紫杉醇減少了的 62%的腫瘤重量 (P ,兩者 )。 (圖W4A) 考慮到 STAT3的耐藥性，我們還進(jìn)行了紫杉醇耐藥 HeyA8MDR 模型實(shí)驗(yàn) (圖2 B)。腫瘤節(jié)數(shù)量也有類似的效果（圖 2）。腫瘤細(xì)胞注射到脾臟后，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到肝臟。與對(duì)照組相比，奧沙利鉑和 STAT3 siRNA / rHDL 偶聯(lián)治療可使腫瘤重量（ 96 ％， P ）和肝臟中轉(zhuǎn)移損壞數(shù)目（ 86％ ， P ）顯著減少。我們?cè)?SKOV3ip1原位卵巢癌模型中用 FAK siRNA / rHDL 納米粒靶向 FAK(圖 2 C)。 STAT3 靶向 腫瘤微環(huán)境的 影響 為了了解 STAT3 / rHDL 的生物效應(yīng)，在藥物敏感的 (SKOV3ip1)和藥物耐藥(HeyA8MDR)卵巢癌模型中進(jìn)行一系列的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組 比較， STAT3 siRNA / rHDL 和多烯紫杉醇偶聯(lián)治療可顯著降低細(xì)胞增殖 (39%， P ）。同樣 ,在 HeyA8MDR 模型 中，就 多烯紫杉醇 處理對(duì) MVD 的降低沒有影響， 但多烯紫杉醇 和 STAT3 siRNA / rHDL 偶聯(lián)治療可顯著降低 (圖W6)。與對(duì)照組 (P )相比， STAT3 siRNA / rHDL 和多烯紫杉醇的聯(lián)合治療可增加30倍的腫瘤細(xì)胞凋亡。從表中知，我們 使用 RTPCR 驗(yàn)證 STAT3基因沉默后最顯著改變的 12個(gè)基因 (圖 4 C)。在 HeyA8MDR 模型中也有類似的結(jié)果 (數(shù)據(jù)未顯示 )。與多烯紫杉醇治療相比， STAT3 siRNA 可增高 41%的細(xì)胞凋亡 (P )，這表明在體內(nèi)凋亡效應(yīng)的確實(shí)受到直接影響 (圖 5A)。生物效果是通過降低腫瘤細(xì)胞增殖，減少降低血管生成，降低細(xì)胞生存率來評(píng)估。因此 ,非特異性遞送系統(tǒng)可能需要更高的劑量來達(dá)到有效性和持續(xù)的基因沉默。我們的數(shù)據(jù)表明，與正常組織相比，SRB1受體在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)增加 。此外 ,我們的安全研究表明，對(duì)照組 siRNA 相比， STAT3 / rHDL 在小鼠肝臟中吸收沒有任何不良反應(yīng)。即使 STAT3被廣泛認(rèn)為是一個(gè)重要的癌癥啟動(dòng)子，傳統(tǒng)治療方法因其 靶向性受到的限制。所以，藥理干預(yù)靶向 STAT3對(duì)于這里描述的納米技術(shù)是可能的。 FAK siRNA / rHDL 治療方法具有高度腫瘤特異性，可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移并且對(duì)其他器官無明顯副作用。 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 Figure of SRB1 mRNA in different human ans and tumors using RTPCR. Actin is used as a loading control. 基于脂蛋白納米載體的小干擾 RNA 靶向遞送方法研究 Figure of systemic delivery of fluorescentlabeled siRNA/ control siRNA/rHDL or untagged siRNA/rHDL was injected (IV or IP), and 48 hours later, ans were harvested. Freshfrozen tissues were counterstained with Hoechst, and the level of fluorescentlabeled siRNA (red) was assessed with fluorescent microscopy. Average fluor
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