【年會報告】-xxxx生物教育年會報告基因工程與細(xì)胞工程-wenkub
2023-02-24 17:04:00 本頁面
【正文】 和引物。對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。為什么要建基因文庫？ 從基因文庫中篩選目的基因： 核酸雜交 和 PCR： 免疫學(xué)檢測 （抗原抗體反應(yīng)）探針n 探針 是一小段帶標(biāo)記的單鏈 DNA或者 RNA片段（大約是 20到 500bp）， 用于檢測與其互補的核酸序列。結(jié)構(gòu)基因外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄、加工修飾mRNAcDNA文庫文庫反轉(zhuǎn)錄酶 cDNA克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定 構(gòu)建基因文庫的基本程序1)提取研究對象基因組 DNA，制備合適大小的 DNA片段，或提取組織或器官的 mRNA并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA；2) DNA片段或 cDNA片段與經(jīng)特殊處理的 載體 連接形成重組 DNA；3)重組 DNA轉(zhuǎn)化 宿主細(xì)胞 或體外包裝后侵染受體菌；4)陽性重組菌落或噬菌斑的篩選。u基因文庫由外源 DNA片段 、 載體 和 宿主細(xì)胞組成。 基因組文庫 (Genomic library)n 將某種生物體的 全部基因組 DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的 DNA片段，再與合適的 載體 在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的 宿主細(xì)胞 獲得的所有陽性菌落?；蚪M DNA文庫 cDNA文庫基因組文庫的類型 根據(jù)所選用的 載體 可以分為： 質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。 n 最初是使用帶放射性的 DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。特點：免疫篩選法（一）放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）+免疫沉淀檢測法菌落沉淀素免疫篩選法（二）PCR法獲取目的基因已知基因：n 設(shè)計合成一對引物，直接從基因組 DNA中擴(kuò)增該目的基因。n 磷酸二酯法n 亞磷酸三酯法獲取目的基因的方法n一般來說：n 目的基因的獲得通常采用 PCR法；化學(xué)合成法由于合成的片段較短，一般用于引物和探針的合成；基因文庫一般用于保存基因資源。 分子雜交的方法 通常是采用各種方法將核酸（蛋白質(zhì)）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等標(biāo)記的探針（抗體）與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影（顯色）后顯示出目的核酸（蛋白質(zhì)）分子。n (4) 讓探針與同源 DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。 Northern雜交 (檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA）Northern雜交的過程 ① 提取總 RNA ② 分離 mRNA： 利用親和層析的原理純化 mRNA。其基本原理是通過 特異性抗體 對凝膠電泳分離的細(xì)胞或生物組織 蛋白樣品 進(jìn)行檢測。 Western雜交結(jié)果圖常見載體容量載體 質(zhì)粒 λ噬菌體黏粒 細(xì)菌人工染色體（BAC）酵母人工染色體（YAC）容量（ kb)10 23 45 350 1000（二）細(xì)胞工程動物細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合（ cell fusion)， 又稱體細(xì)胞雜交，是指兩個或更多個相同或不同細(xì)胞通過膜融合，形成單個細(xì)胞的過程。其缺點是操作過程繁瑣， PEG可能對細(xì)胞有毒害。融合細(xì)胞的篩選 n 細(xì)胞融合后，會形成由未融合的親本細(xì)胞、同核體以及異核體組成的細(xì)胞混合群體?？贵w結(jié)構(gòu) n 抗體是具有 4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，其中 2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈 (H鏈 )；2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈 (L鏈 )?？勺儏^(qū)位于 “Y”的兩臂末端?？贵w多樣性的遺傳學(xué)基礎(chǔ) n 抗體的 L鏈?zhǔn)怯?C、 V、 J三個基因簇編碼的， H鏈由 C、
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